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基因敲除细胞株5步构建流程

2023-01-10 10:29:39
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  如果选择的方法不对,或者细胞株不对,不同的细胞株做基因敲除细胞系的改造会有什么变化呢?筛选细胞是基因敲除细胞成败的重要环节!如果没有正确的方法那么基因敲除的细胞株工作就不能顺利的进行,首先要知道影响基因敲除细胞系的主要关键点是什么?其次是要了解和熟悉具体的实验流程和实验步骤,让自己轻松的完成基因敲除细胞株的构建流程。

  一. 如何选择基因敲除的细胞:

  1.关键点:支原体污染在绝大部分的实验室里都不太被重视,如果支原体污染了细胞,则会导致细胞产生很多问题:如细胞的增殖问题,同时还会影响细胞的代谢,产生的数据也会有很大的误差,所以在实验室里的技术人员都需要非常重视。

  2.检测方法有两种:细胞培养和PCR鉴定。

  3.基因敲除的优势:克隆形成率高,敲除效率高,细胞容易增殖,但是有一个例外就算是做了细胞基因敲除株的构建,也无法获得基因敲除的单克隆细胞,那就是没有多基因的问题;染色体不突变;难增殖的细胞;细胞的数量有限;做基因敲除细胞株难以得到纯合子敲除的细胞系的原因就是克隆的拷贝数太多。

  4具体原因:只能是肿瘤细胞系,不能是永生细胞系,往往很多永生细胞系做起来都比较有挑战性,当在做基因敲除细胞株时,如果敲除效率是x,则拷贝数是n,那么纯合敲除的效率就是:x^n,可见效果就不显著了。

  二. 基因敲除细胞系的敲除方法:

  1.建议首选:如果只是做常规的移码敲除,那么一个细胞里面只有2个基因位点,是很难保证两个基因位点是一样的移码,所以得到移码的数据也不同,当你在鉴定测序看图的时候就没有那么清晰,所以,选择片段敲除是一个较为有效的办法。

  2.关键点:移码敲除在很多时候并不彻底,会在后续的实验中出现Western Blot的问题,出现神秘的条带,大片段的基因敲除是几kb的缺失,mRNA就没有目的蛋白的转录,Western Blot问题也解决了,鉴定敲除方法:纯合敲除细胞系,比移码敲除效率更高。

  3.如何判断是大片段敲除的细胞系:主要是通过目的基因片段对PCR扩增的方式判断。

  三. 细胞周期分析:

  1.如果采用病毒法,构建载体,病毒包装,转染细胞,细胞筛选,单克隆,PCR鉴定/测序,扩增——一个步骤都不能少。

  2.使用转座子系统,构建好敲除质粒后,直接用质粒电转到细胞。

  3.做基因敲除细胞株时,不要选择增殖太慢的,如果过表达量的Cas9蛋白+gRNA快速靶向,最快只需要5周时间,7-12周就可以得到纯合子细胞。

  四.细胞拿到怎样用:

  如果是单克隆的细胞需要大量扩增,完全不用担心培养过程中蛋白恢复的问题,所有的细胞都必须经过严格测试,保证安全无污染,低内毒素可以直接用于动物体内实验,做代谢分析也能更加安心。如果移码突变,大量扩增可能会出现恢复(特别是敲除的蛋白对细胞增殖有优势的情况)细胞动物实验和代谢研究更放心。

  五.诱导系统:

  外源蛋白的诱导表达/沉默能很好比较本底和干预的区别,非常有力的诠释目的基因/蛋白的作用机理,特别适合研究自身具有毒性的蛋白,现已经被广泛使用。

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