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荧光定量PCR的原理

2022-12-14 10:41:27
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  荧光定量聚合酶链反应(qPCR)是一种用于测定基因表达水平或病毒滴度的常用技术。该技术利用特殊的发光标记探针来检测特定的基因序列或病毒的存在。检测过程中,荧光探针会与基因序列或病毒的 RNA 结合,随着聚合酶链反应进行而发光。荧光强度与所检测到的基因或病毒的量成正比,因此通过测量荧光强度来估算基因表达水平或病毒滴度。

  荧光定量PCR的原理qPCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。而qPCR的方法相应的可分为特异类和非特异类两类,特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物;而非特异性检测方法是在PCR反应体系中,加入过量荧光染料,荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射出荧光信号。前者由于增加了探针的识别步骤,特异性更高,但后者则简便易行。

  (1)荧光探针法

  Taqman荧光探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。当探针完整时,发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;当PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离,从而荧光监测系统可以接收到荧光发射基团荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步,从而实现定量。目前常用的荧光基团有FAM, TET, VIC, HEX。

  (2)荧光染料法

  目前常用的荧光染料是SYBR Green I,是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料,在游离状态下,SYBR Green I发出微弱的荧光,但一旦与双链DNA结合后,荧光大大增强。因此SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。


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