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细胞增殖检测方法,快速检测细胞增殖

发布时间:2022-10-17 10:28:04 阅读:11122次 来源:CellMax胎牛血清

  目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法:

  一种是直接的方法,通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。例如:Ki67细胞增殖检测;BrdU细胞增殖检测;EdU细胞增殖检测。

  另一种是间接的方法,即细胞活力检测方法,通过检测样品中健康细胞数目来评价细胞的增殖能力。显然,细胞活力检测方法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。例如:MTT法、CCK8试剂盒法。

  MTT比色法:

  是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

  ‚CCK8试剂盒法:

  CCK-8试剂盒是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。CCK-8的原理跟MTT其实是相同的,不同之处在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的,不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤,因此可以减少一定的误差。

  ƒKi67细胞增殖检测:

  Ki-67抗体识别同名蛋白,在细胞周期 S期、G2期和M期表达,而在G0期和G1期(非增殖期)不表达。用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增殖情况。

  „Brdu细胞增殖检测:

  „Brdu为胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期),活体注射或细胞培养加入,而后利用抗Brdu单克隆抗体,ICC染色,显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物,双重染色,可判断增殖细胞的种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义。

  但由于抗体分子量大,难于掺入并被有效检测,因此BrdU检测需采用DNA酶或HCl或加热使DNA变性。对于植物细胞等有细胞壁的分析,采用抗体检测还需要消化细胞壁,细胞壁消化酶常含有一些杂质,会导致检测的可靠性降低,同时BrdU检测则需要进行长时间的孵育--几个小时甚至过夜。

  …EdU细胞增殖检测:

  …EdU(5-Ethynyl-2’- deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中,通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性,适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究,尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。

  与BrdU检测方法相比,EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU染料只有BrdU抗体的1/500,在细胞内很容易扩散,无需DNA变性(酸解、热解、酶解等),可有效避免样品损伤,而且无需抗原抗体反应,能在细胞和组织水平更准确地反映DNA复制活性。

  BrdU与EdU方法比较:

图例

  EdU实验步骤:

  (1)实验准备:1×细胞PBS(PH 7.4),渗透剂(含0.5%TritonX-100的PBS),甘氨酸溶液(2mg/mL),细胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)。

  (2)细胞培养:取对数生长细胞,以每孔4×103~4×105细胞接种于96孔板中,培养至正常生长阶段;

  (3)转染或加药培养;

  (4)EdU标记:(此步务必在超净台内完成)

  a.用细胞培养基按1000 : 1的比例稀释EdU溶液(试剂A),制备适量50 μM EdU培养基;

  b.每孔加入100 μL 50 μM EdU培养基孵育2小时,弃培养基;

  c.PBS清洗细胞1-2次,每次5 min,清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱。

  (5)细胞固定化:

  a.每孔加入50 μL细胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)室温孵育30 min,弃固定液;

图例

  b.每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸,脱色摇床孵育5 min后,弃甘氨酸溶液,目的是中和多聚甲醛,保证染色反应体系;(注:甘氨酸溶液需去离子水配置,现用现配)

  c.每孔加入100 μL PBS,脱色摇床清洗5 min,弃PBS;

  d.每孔加入100 μL渗透剂(0.5%TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10 min,PBS清洗一次,5 min。

  (6)Apollo染色:

  a.每孔加入100 μL的1×Apollo染色反应液,避光、室温、脱色摇床孵育30 min,弃染色反应液,Apollo®染色液配制参考表2-13;(注:现用现配,按顺序加试剂,30min内用完,以免影响反应体系;试剂E是粉末,容易氧化,操作时需注意,如果氧化成黄色,说明可能失效

  b.加入100 μL渗透剂(0.5%TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2-3次,每次10 min,弃渗透剂;

  c.由于某些细胞对染料的吸附性较高,需采用加强方式洗脱以降低染料背景,(加强)每孔每次加入100 μL 甲醇清洗1~2次,每次5 min,PBS清洗1次,每次5 min。

  (7)DNA染色:

  a.用去离子水按100:1的比例稀释试剂F,制备适量的1×Hoechst33342反应液,避光保存;

  b.每孔每次加入100 μL 1×Hoechst33342反应液,避光、室温、脱色摇床孵育30 min后,弃染色反应液;

  c. 每孔每次加入100 μL PBS清洗1-3次,每孔加入100 μL PBS保存待用。

  (8)图像获取及分析:用激光共聚焦显微镜观察并照相,注意避光操作。(注:4℃湿润保存,但最多不超过3天。)


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