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原代细胞培养和传代培养该用什么方法

发布时间:2022-10-08 10:23:48 阅读:11602次 来源:百度学术

  原代细胞 (primary culture cell)是指从机体取出后立即培养的细胞。

  原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究,如蛋白质组学、基因组学、细胞株(系)研究、DNA,RNA和遗传学研究等,还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。其在生物医药领域有不可替代性作用,市场前景广阔。

  有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。而它,也是建立细胞系的第一步。

原代培养

  原理:

  将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。

  仪器、材料及试剂:

  仪器:培养箱(调整至37°C),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37°C)

  材料:动物组织块

  试剂:1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s液,碘酒

  初代消化培养法:

  准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

  布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。

  处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

  剪切:用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。

  消化:或用恒温水浴,或置于37°C温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

  分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。

  计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整。

  培养:置于36.5°C温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。

  初代组织块培养法

  剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

  摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

  轻轻翻转培养瓶,另瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,塞好瓶塞,置36.5°C温箱培养2小时左右(勿超过4小时),使小块微干涸。

  培养:从微箱中取出培养瓶,开塞,46度斜持培养瓶,箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

  细胞传代培养是在原代培养成功之后,组织培养常规保种方法之一,也是几乎所有细胞生物学实验的基础。随着培养时间的延长细胞不断的分裂,当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶,细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。

  传代培养可获得大量细胞供实验所需,它需要在严格的无菌条件下进行,每一步都需要认真仔细的无菌操作。

传代培养法

  原理

  细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

  材料和试剂

  1.细胞:贴壁细胞株

  2.试剂:0.25%胰酶、1640培养基(含10%小牛血清)

  3.仪器和器材:倒置显微镜,培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

  操作步骤

  1.吸除培养瓶内旧培养液;

  2.向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许,以能覆满瓶底为限;

  3.置温箱中2~5分钟,当发现细胞质回缩,细胞间隙增大后,立即终止消化;

  4.吸除消化液,向瓶内注入Hanks液数毫升,轻轻转动培养瓶,把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时,动作要轻,以免把已松动的细胞冲掉流失,如用胰蛋白酶液单独消化,吸除胰蛋白酶液后,可不用Hanks液冲洗,直接加入培养液;

  5.用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞,使之从瓶壁脱离形成细胞悬液;

  6.计数板计数后,把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中,置温箱中培养。

  无菌操作注意事项

  1.操作前要洗手,进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试,试剂等瓶口也要擦拭;

  2.点燃酒精灯,操作在火焰附近进行,耐热物品要经常在火焰上烧灼,金属器械烧灼时间不能太长,以免退火,并冷却后才能夹取组织,吸取过营养液的用具不能再烧灼,以免烧焦形成碳膜;

  3.操作动作要准确敏捷,但又不能太快,以防空气流动,增加污染机会;

  4.不能用手触已消毒器皿的工作部分,工作台面上用品要布局合理;

  5.瓶子开口后要尽量保持45°C斜位;

  6.吸溶液的吸管等不能混用。


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