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琼脂糖凝胶电泳实验技巧(包括脂糖凝胶制作步骤)

发布时间:2022-08-19 10:25:55 阅读:14712次 来源:百度学术

  琼脂糖凝胶电泳与其他支持物电泳主要区别是:它兼有"分子筛"和"电泳"的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相比于蛋白质太小,对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道,故琼脂糖凝胶电泳是核酸分析常用的实验技术。

  琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速,通过调整其使用浓度,使得分辨率达到大多数实验的要求,因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。但操作过程中仍有不少要注意的问题。以下内容对初涉分子生物学实验者有一定的指导意义。

  1 凝胶制作

  1.1 凝胶浓度

  配制凝胶的浓度根据实验需要而变,一般在0.8%~2.0%之间,下表是不同凝胶浓度对DNA分子的有效分离范围。

图例

  如果一次配制凝胶100 ml,没用完的凝胶可以再次融化,但随着融化次数的增加,水分丢失也越多,凝胶浓度则会越来越高,导致实验结果不稳定,补水办法有两个:一是在容器上标记煮胶前的刻度,煮胶后补充相应的水分至原刻度;二是在煮胶前称重,煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。

  1.2 梳板的选择

  一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板,梳板的选择主要是看上样量的多少而定,一般来说,上样量小时尽量选择薄的梳板制胶,此时电泳条带致密清晰,便于结果分析。另外,每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm,否则,拔梳板时易损坏凝胶孔底层,导致点样后样品渗漏。当然,点样孔的破坏还与拔梳板的时间和方法有关,一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板,拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中,然后垂直向上慢慢用力,因为有液体的润滑作用,梳板易拔出且不易损坏点样孔。

  2 点样

  在样品中加入上样缓冲液,上样缓冲液中含有甘油或蔗糖以增加密度,使样品沉入孔底;上样缓冲液中一般还含有两种指示剂,溴酚兰和二甲苯青,用于指示样品的迁移过程。上样缓冲液储存液一般为6×(10×),表示其浓度为工作浓度的六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液器基本垂直对准点样孔,用另一只手帮助固定移液器下端,移液器枪头进入点样孔即可将样品注入孔内,千万不可插至孔底。同时DNA分子上样大小应基本在分子量标准范围之内。

  3 电泳

  将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连,负极与负极相连。核酸带负电荷,从负极向正极移动。电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同,电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm为好,电泳缓冲液太多则电流加大,凝胶发热。电泳时所加电压一般不超过5v/cm(指的是正负电极之间的距离,而不是凝胶的长度),电泳时间一般为30~60 min,根据实验需要也可作适当调整。电压增高,电泳时间缩短,核酸条带相对来说不够整齐,不够清晰;相反,电压降低,电泳时间较长,核酸条带整齐清晰。 另外,如果电泳后样品泳动很慢或者没泳动,请检查胶模两端的封口胶条是否已去掉。

  4 结果分析

  较成功的电泳结果是分子量标准条带和样品条带整齐清晰,如果条带模糊暗淡,单从琼脂糖凝胶电泳角度来说,可能的原因:溴化乙锭的质和量怎样?溴化乙锭见光易分解,母液配制时间过长或保存不当;电泳槽中缓冲液使用次数过多,缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液,一般用2~3次就要更换,TBE缓冲液则可使用10次左右。溴化乙锭(EB)是一种中等强度诱变剂,操作过程中要戴手套,并将加有EB的染色液作好标记、妥善保存。除了EB外,也可以使用Golden View,10000xSybr green I,AidGreen(GelGreen)核酸染料等进行替代。


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