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外泌体提取及鉴定方法分享

发布时间:2022-07-25 10:12:17 阅读:15492次 来源:普诺赛

  外泌体(Exosome) 指包含了复杂RNA和蛋白质的膜性囊泡,其直径在30-150nm左右。存在于所有生物体液中,包括血液、唾液、尿液、滑液、羊水、乳汁、细胞培养液等。不论是正常细胞还是肿瘤细胞,都能够产生外泌体。

  外泌体富含胆固醇和鞘磷脂,具有脂质双分子层结构;此外,外泌体还含有蛋白质和核酸。不同细胞来源的外泌体中所含有的生物分子具有细胞种属特异性,其外泌体特异性与来源细胞相符合。

图例

  外泌体提取方法

   超速离心法:

  目前外泌体分离的金标准,且为外泌体提取的最常用方法,方法成熟,适用于大体积样本。

   沉淀法:

  操作简单,快速,回收率高。

   超滤法:

  操作简单省时,可在低转速下得到外泌体,不影响外泌体的生物活性。

   亲和层析法:

  保证外泌体形态完整,特异性高,操作简单,无需特殊昂贵的仪器设备。

  上述几种方法,方法一、二、三提取的纯度不够,方法四提取的量不够,我们可以将这两组方法综合起来,先用方法一、方法二、方法三粗略提取外泌体,再用方法四提纯外泌体。

  外泌体获取

图例

  外泌体鉴定

  据国际细胞外囊泡学会(ISEV)在2014年的提议,外泌体鉴定3个标志:透射电镜(transmission electron microscope,TEM)、粒径(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)、蛋白标志物(Western Blot, WB)。

  TEM:

  外泌体透射电镜分辨率为0.1~0.2nm,适合外泌体双层囊膜超微结构观察,可观测样本中是否存在外泌体样结构(通常为茶托型或一侧凹陷的半球形,如图1),同时可测量外泌体大小。

电镜下的外泌体结构NTA:

  图1. 电镜下的外泌体结构NTA:

  该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快,检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。

  WB:

  外泌体Western blot检测可含内参检测,外泌体中的β-Actin的表达丰度相对于正常细胞样品中的较低,外泌体WB检测时可能会检测不到任何条带或者条带微弱。

  外泌体应用

  #1

  外泌体作为药物载体,实现靶向给药。外泌体具有负载“货物“并将其传递给靶细胞的能力, 可用于细胞间通讯,尤其是远距离通讯。以外泌体作为药物转运载体,具有免疫源性低、运输效率高、稳定性好和靶向性强以及能跨越血脑屏障等独特优势。外泌体也适合递送各种化学物质、蛋白质、核酸等。Buller B等将负载 miR-146的外泌体注射至患有角质细胞瘤小鼠的肿瘤部位,发现miR-NAs有效的抑制了肿瘤的生长。

  #2

  疾病诊断的分子标志物。不同疾病的不同类型细胞都能分泌含有不同miRNAs和RNAs的外泌体,使得从病人的体液中分离外泌体作为疾病诊断成为可能,尤其在肿瘤诊断中。除此之外,外泌体还可以应用于非肿瘤疾病的诊断。Welker M W等研究发现血清外泌体CD81可能是慢性丙型肝炎诊断的潜在蛋白标志物。

  #3

  促进组织修复和再生。近年的研究发现,干细胞来源外泌体是干细胞旁分泌活动的一种重要方式,可介导其促进组织再生。Chen等发现,ADSCs-exo 的联合治疗可减少大鼠急性缺血性卒中的梗死面积,促进神经功能恢复。ADSCs-exo可以避免干细胞治疗的免疫排斥、伦理问题等缺点,且具有高稳定性、易于储存、无需增殖、便于定量使用等优势,与单一的细胞因子比较,具有较高的安全性和更大的组织再生潜能。

  ●参考文献●

  [1] 吴金恩, 丁军涛. 外泌体生物学功能及应用研究进展[J]. 动物医学进展, 2016, 37(12):5.

  [2] 陈筑昕. 脂肪干细胞来源外泌体促进组织修复的应用进展[J]. 组织工程与重建外科杂志, 2018, 14(4):4.

  [3] Katakowski M , Buller B , Zheng X , et al. Exosomes from marrow stromal cells expressing miR-146b inhibit glioma growth[J]. Cancer Letters, 2013, 335(1):201-204.

  [4] Lv L L , Cao Y H , Pan M M , et al. CD2AP mRNA in urinary exosome as biomarker of kidney disease[J]. Clinica Chimica Acta, 2014, 428:26-31.

  [5] Chen KH, Chen CH, Wallace CG, et al. Intravenous administration of xenogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSC) and ADMSC -derived exosomes

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1405.html

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