间接血凝试验实验原理

　　若将可溶性的鼻疽抗原吸附在比其体积大千万倍的红细胞表面上，使红细胞产生一种新的血清学性质，制成所谓的致敏红细胞，即可用以诊断鼻疽。只要与少量相应抗体相遇，红细胞通过抗原抗体反应，即可被动地结合在一起，呈现肉眼可见的凝集现象，阴性者红细胞由于自然沉积于孔底，则呈圆点状。这样可以明显地提高反应的敏感性。

　　间接血凝试验即间接红细胞凝集试验，它也存在一些缺点，例如不同批次制备的抗原或红细胞，在敏感性和稳定性方面，可能不一致，它很容易受外界因素的影响，发生非特异性凝集，所以应用的器皿等就应当清洁，不要有污物或杂质等，遇到非特异凝集时，要做间接凝集抑制试验(indirect hemagglutination inhibition test)，以排除非特异性反应。

　　间接血凝试验实验试剂

　　1. 磷酸盐缓冲盐水(PBS)的配制：

　　甲液：Na2HPO4 21.3 g (或Na2HPO4?12H2O 53.72 g) NaCl 8.5 g

　　乙液：KH2PO4 20.42 g NaCl 8.5 g

　　上述甲、乙液配方各加蒸馏水至1000ml，溶解后，过滤，分别保存。使用时，将甲、乙液混合，再加等量的蒸馏水即配成0.15mol/L不同pH值的PBS，摇匀灭菌备用。

　　pH值甲液：0.15mol/L Na2HPO4、NaCl

　　乙液：0.15mol/L KH2PO4 NaCl

　　2. 1%兔血清缓冲盐水的配制：将新分离的兔血清56℃ 30min灭活后，取所需量(如10ml)加约半量(如0.5ml)的洗过的压积绵羊红细胞，并加兔血清量4倍(如4ml)的pH值7.2 PBS，置37℃水浴箱中作用10min，以吸收兔血清中的异嗜性凝集素，1500 r/min离心10min，吸取上清，加pH值7.2 PBS 9.5ml，即为1%兔血清PBS液，置4℃冰箱中，可保存2天。

　　3. 阿氏液(Alsever’s solution)的配制：按以下配方配制，调正pH值6.1，过滤后分装小瓶，以113℃高压蒸气灭菌15min后，置4℃冰箱中备用。

　　枸橼酸钠(Na3C6H5O7?5H2O)0.8 g

　　葡萄糖2.05 g

　　枸橼酸0.0325 g

　　氯化钠0.42 g

　　蒸馏水加至100 ml

　　4. 红细胞：无菌采取绵羊血液于阿氏液中，于4℃冰箱中保存，可供3周内使用。

　　5. 固定剂：25%戊二醛溶液。

　　6. 鞣酸溶液：所用鞣酸必须是纯品，用前用双馏水配成1/200溶液(使用时，再用pH值7.2 PBS配成所需浓度)，放4℃冰箱中保存，可供一周内使用。

　　7. 鼻疽抗原及被检马血清(56℃ 30min灭活)。

　　间接血凝试验实验设备

　　1. 血清反应板：为有机玻璃(聚甲基丙烯酸甲酯)制成，目前常用的为96孔板，长132cm，宽84cm，厚12cm。板孔的形状基本有两种，即尖底的(V形)和圆底的(U形)，其中V形板可供血凝试验用，它较U形板具有更典型的凝集终点；U形板用于补体结合试验较好。96孔V形板的孔径为0.6cm，每孔的总容量为0.25ml。

　　用过的血清板，可以0.1%新洁尔灭、3%～5%次亚氯酸钠或5%甲醛溶液浸泡1～2h，或用紫外线消毒，但不能用来苏儿，因它可使血清板变色，如为无传染性的被检材料，可直接用清水冲洗3～4次后，晾干备用。由于血清板的硬度不够，容易擦毛，所以洗擦时，可用纱布轻抹，不能用手指或硬布擦表面，以免发毛。清洗时，水温不能超过90℃，以免变形。

　　2. 微量滴管：国内尚无定型产品，可自行加工。所用玻璃滴管长约20cm，于1/4处有一球形膨大部，下端接针头处为磨口的，把16G号针头磨平(即将针尖适当磨钝，以调正液滴大小，使每毫升恰为40滴)，使每滴量为0.025ml，上端接小乳头。加液时，要使滴管与血清板成垂直位置，以尽量使每滴液体的量相同。

　　3. 稀释棒：金属制品。全长约20cm，头部为合金钢制成，呈灰白色(氧化的金属)，表面微粗糙些，以达到有效地吸取液体和吸取液体的一致性，为了长期保持棒头的氧化层，吸取的即便不是带菌的液体，每使用20次，棒头也应过火一次，可烧至暗红色，但不能烧至鲜红。棒头能蘸吸、移液和混合液体，能吸取液体是由于毛细管的作用和表面的粘附作用。目前国内制造的棒头上有8条纵沟，吸液量为0.025ml。

　　4. 微量血液振荡器：为特制其振摇血清板的，可使孔内的各要素混合的更均匀。

　　间接血凝试验实验步骤

　　1. 红细胞的致敏方法

　　1) 红细胞醛化：用新鲜红细胞作间接血凝，不但红细胞凝集的模型新鲜、典型，而且敏感性也好，但致敏红细胞保存的时间短，而且由于不同批次或不同动物个体的细胞具有一定的差异，可造成试验结果不一致，影响对结果的分析。为了克服这一缺点，目前多采用醛化法(如甲醛、戊二醛或丙酮醛)固定红细胞，制备致敏红细胞。经醛化的红细胞在普通冰箱中?保存1年以上，而且无明显的溶血现象，致敏后的红细胞敏感性，一般来说，与新鲜红细胞没有明显的差别。

　　取阿氏液保存的血液，用pH值7.2 PBS洗3次，每次均为3000r/min 3min，zui后一次去上清，取沉积的红细胞2.5ml，加1%戊二醛(取25%冷戊二醛10ml和pH值7.2 PBS 240ml混合制成) 250ml，于4℃冰箱中醛化50min，中间振摇4~5次，取出后仍呈深红色，极粘稠地沉积于离心管底，须强力方能搅拌起来，再以pH值7.2 PBS连续洗3次，每次均为3000r/min 3min，zui后一次去上清，加入含0.01%硫柳汞的pH值7.2 PBS 22.5ml，即为10%戊二醛化红细胞液，置4℃冰箱中保存zui少可用1年。

　　2) 醛化红细胞鞣酸化：以10%醛化红细胞12ml，加pH值7.2 PBS 8ml，以3000 r/min离心3min，如此洗2次，去上清，再加pH值7.2 PBS 4ml，即为3%红细胞悬液，加4ml 1∶20 000鞣酸(1/200鞣酸用pH值7.2 PBS稀释)，于37℃水浴中加温15min，其间不断振摇，使之充分作用，加温完毕，以pH值7.2 PBS洗2次，每次均3000 r/min 3min，倾去上清，加4ml pH值7.2 PBS，即为3%鞣酸化红细胞液。

　　3) 鞣酸化红细胞致敏：取鼻疽补反用抗原，以pH值6.4 PBS将其1∶100稀释，以4ml稀释的抗原加往鞣酸化红细胞液4ml中，于37℃水浴中作用30min，以3000 r/min离心3min，去上清后，再加8ml 1%兔血清缓冲盐水，即为间接血凝用15%致敏红细胞诊断液(须加0.01%硫柳汞防腐)，置普通冰箱中可保存0.5～1年。对照用红细胞诊断液，按上述方法以pH值6.4 PBS处理鞣酸化红细胞即可。

　　操作方法

　　2. 实施反应的操作方法：用微量滴管吸取1%正常兔血清pH值7.2 PBS分别滴加于血清板相邻两列孔中，每孔一滴即0.025ml，再取2支预湿的棒头(先通过火焰烧红、冷却，放蒸馏水或生理盐水的液面上预湿1min，注意不能将整个棒头都浸到液体中，否则会有残留液体，造成不正确的结果，再用吸水纸吸潮、校准)分别蘸取1∶100稀释的被检血清(56℃ 30min加热灭活)0.025ml，各插入上下二列的第1孔稀释液中，进行捻转对倍稀释，捻转稀释棒的速度要适当，太慢混合不均，太快易造成泡沫，使得稀释不准，通常每秒钟捻转2～3次为适宜，稀释后血清第1～7孔的稀释度分别为1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800，第8孔不加血清，为1%兔血清PBS对照。再用微量滴管吸取鼻疽抗原致敏的红细胞诊断液往*列的每一孔中滴加0.025ml，再换另一支微量滴管吸取对照用鞣酸化细胞液滴加于第二列的每一孔中，每孔也为0.025ml。然后将血凝反应板置于微型血液振荡器上，振摇3～5min，充分混匀，取下反应板，将其放于事先铺有湿纱布的搪瓷盘内，置37℃恒温箱中1～15h(夏季放室温下也可以)，取出观察结果，必要时放室温下过，再一次观察反应结果，并作终判。

　　3. 结果判定

　　判定时，应首先看对照孔，只有在各个对照孔完全正确的情况下，说明反应条件正常，方可对被检血清列的结果作判定。

　　间接血凝试验注意事项

　　1. 红细胞也可用新鲜的，但凝集模型不稳定，且不能长期保存，如现用现采，不能保证各次试验结果的一致性。

　　2. 所用红细胞的种类除绵羊细胞以外，还可应用人的O型红细胞，及鸡、马的红细胞等。

　　3. 被检标本的稀释应力求准确，特别是使用稀释棒进行稀释时，稀释棒的旋转次数或时间应相对固定，一般每个稀释度可旋转稀释50～100次，稀释棒应尽量不碰及血清板边缘。

　　4. 血凝试验中，所用致敏红细胞浓度，对试验结果的敏感度影响很大，一般说，红细胞浓度偏高，则终点效价低，红细胞浓度低，则终点效价高，故红细胞浓度力求准确稳定。

　　5. 稀释液中的正常兔血清须经56℃ 30min灭能，并用与致敏同批号的绵羊红细胞充分吸收，以去除非特异性凝集素。

　　6. 稀释棒用毕，以水冲洗干净，用滤纸将水吸干，于火焰上将棒头烧红，冷却后再用