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细菌中蛋白质的提取与纯化方法步骤

2022-06-04 10:32:26
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  细菌中蛋白质的提取与纯化实验试剂

  1. 使用前,将RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。

  2. 按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer,并于室温保存。

  D6948-00B: 加入8ml无水乙醇

  D6948-01B: 加入80ml无水乙醇

  D6848-02B: 加入80ml无水乙醇

  细菌中蛋白质的提取与纯化实验步骤

  1. 取1.5-5ml 菌液10,000 x g室温离心1min收集菌体沉淀;

  2. 小心去除上清液,加250ul Solution I/RNase,涡旋或用移液枪上下吹打重悬菌体。

  3. 加250ul SolutionⅡ,来回颠倒4- 6次轻柔混匀,得到澄清的裂解液。

  4. 加125ul Buffer N3,颠倒混匀几次直至出现白色絮状沉淀,室温放置2-3min让其充分反应。

  5. 12,000×g 室温或4℃离心10min得上清,把上清转移到一个新的离心管内;

  6. 加入与上清等体积的ETR Binding Buffer,颠倒混匀7-10次,室温放置5min。

  7. 结合质粒——把结合柱插入2ml收集管,每次转移700ul混合液至结合柱柱里,8,000×g离心1min,弃滤液。

  8. 重复第7步,直至所有上清都过滤完,弃滤液。

  9. 加入500ul ETR Wash Buffer到结合柱上,8,000×g离心1min,使全部液体滤过柱子,弃滤液。

  10. 加入500ul Buffer EHB到结合柱上,8,000×g离心1min,使全部液体滤过柱子,弃滤液;

  11. 加入700ul DNA Wash Buffer到结合柱上, 8,000×g离心1min使全部液体滤过柱子,弃滤液;

  注意:浓缩的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释。

  12. 加入700ul DNA Wash Buffer到结合柱上,8,000×g离心1min使全部液体滤过柱子,弃滤液;

  13. 把空柱子套回离心管,zui大转速(不超过13,0 0 0×g)离心2min干燥柱子;

  14. 把结合柱套在一个新的1.5ml离心管中,加入30-50ul Endotoxin-Free Elution Buffer,室温放置2-5min,zui高转速离心1min洗脱质粒DNA。


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