您的位置:首页>>公司动态>>行业资讯

免疫沉淀法实验步骤(针对天然蛋白质)

发布时间:2022-05-27 10:36:34 阅读:12892次 来源:百度学术

  本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法,进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。

  A. 溶液与试剂

  :利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 的 1X PBS,将50 ml 20X PBS 加入到 950 ml dH2O 中,并混匀。

  10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 10X 细胞裂解缓冲液加入到 9 ml dH2O 中,并混匀。

  :使用前,立刻加入 1 mM PMSF (#8553)。

  3X SDS 样品缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) ;通过添加 1/10 体积的 30 X DTT 至 1 体积的 3 X SDS 上样缓冲液,制备新鲜的 3 X 还原上样缓冲液。

  Protein A 或 G 琼脂糖珠(针对非偶联的一抗):使用蛋白 A (#9863) 和蛋白 G (#37478) 分别进行兔 IgG 免疫沉淀和小鼠 IgG 免疫沉淀。

  固定的链霉亲和素(偶联珠子)(针对生物素化抗体):(#3419) 轻柔涡旋振荡小瓶,并在每次免疫沉淀法中使用 10 µl。

  10X 激酶缓冲液(激酶测定):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,将 100 µl 10X 激酶缓冲液加入到 900 µl dH2O 中,并混匀。

  ATP (10 mM) (激酶测定):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM),将 10 µl ATP (10 mM) 加入到 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

  B. 制备细胞裂解物

  吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。

  在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。

  去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。

  从板上刮下细胞,把提取物转移至微量离心管。置于冰上。

  在冰上进行 3 次超声破碎,每次 5 秒。

  在 4°C,在 14,000 x g 条件下,微量离心 10 分钟,将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

  C. 免疫沉淀法

  细胞裂解物预清除(对于非接合和生物素化抗体为可选步骤。)

  重要事项:强烈建议使用相应的同型对照,以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗,把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗,把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗,把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗,把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗,Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。

  向浓度为 1 mg/ml 的 200 μl 细胞裂解物中添加 20 μl 蛋白 A (#9863) 或蛋白 G (#37478) 琼脂糖 50% 珠浆、10 μl Streptavidin (Sepharose® Bead Conjugate #3419) 进行生物素化抗体检测。

  在 4°C 下,旋转孵育 30-60 分钟。

  4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。

  根据所使用的一抗,继续下述其中一项的具体步骤。

  使用非偶联的一抗

  将一抗(按产品数据表中建议的合适稀释比例)添加到 200 µl 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。

  添加蛋白 A (#9863) 或蛋白 G (#37478) 琼脂糖(20 µl 50% 珠浆)。轻轻摇动,并在 4°C 下孵育 1-3 小时。

  4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。

  继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析(D 部分)。

  使用生物素化一抗

  将生物素化抗体(按产品数据表中建议的合适稀释比例)添加到 200 µl 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。

  轻柔混匀固定化的 Streptavidin (Sepharose® Bead Conjugate #3419),并加入 10 µl 珠浆。轻柔震荡下,在 4°C 孵育 2 小时。

  4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。

  继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析(D 部分)。

  使用固定化的抗体 (Sepharose® Bead Conjugate)

  轻轻混合,并添加固定的微珠接合物 (10 µl) 到浓度为 1 mg/ml 的 200 µl 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。

  4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。

  继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析(D 部分)。

  使用固定化的抗体 (磁珠偶联)

  轻轻混合,并加入偶联固定化的珠子 (10 µl) 到浓度为 1 mg/ml 的 200 µl 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。

  将试管放在磁性分离架(#7017 或 #14654)上使磁珠沉淀,并等待 1 - 2 分钟,直至溶液变得澄清。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。

  继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析(D 部分)。

  D. 样品分析

  继续下述其中一项的具体步骤。

  :勿离心磁珠。应使用磁性分离架(#7017 或 #14654)。

  用蛋白免疫印迹法进行分析

  在 20-40 µl 3X SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。

  将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 1 分钟。

  将样品 (15-30 µl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。

  用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。

  :对于分子量接近 50 kDa 的蛋白,我们建议使用 Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) 作为二抗,以将变性重链产生的遮盖作用减到最小。对于分子量接近 25 kDa 的蛋白,建议使用 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) 或 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) (#5127)。

  用激酶活性测定法进行分析

  用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。

  在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物,并补充 200 µM ATP 和适当的底物。

  30°C 条件下孵育 30 分钟。

  用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。

  将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。

  将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 1 分钟。

  将样品 (15-30 µl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1197.html

注释:[本文仅供阅读]不代表企业及作者的立场,如侵权请联系删除,欢迎分享本文,转载请保留出处!

推荐服务

  • 分子实验

    分子实验平台为广大科研工作提供蛋白、RNA和DNA分子类分析及检测服务···

  • 细胞实验

    细胞实验平台为广大科研工作者提供原代细胞提取、鉴定和培养相关服务···

  • 病理实验

    动物实验平台为广大科研工作者提供动物寄养、疾病模型构建和体内验证···

  • 动物实验

    动物实验平台为广大科研工作者提供科研成果向产品转化的服务,转化方···

  • 精准医疗

    精准医疗平台为癌症患者提供肿瘤移植动物体内服务,模拟患者癌症发展···