摘要

　　持续性心肌肥大伴有不适应性心脏重塑是导致心力衰竭的临床过程中的早期事件。不适应性肥大被认为是心力衰竭的治疗靶点。然而，调节心肌肥大的分子机制在很大程度上尚不清楚。

　　研究结果

　　图1：miR-223调节心脏中的心肌肥大和心力衰竭。

　　(A)微阵列结果描绘了生理盐水与异丙肾上腺素灌注小鼠miRNA表达强度的对数-对数散点图。

　　(B)在生理盐水或异丙肾上腺素输注时，通过定量逆转录聚合酶链反应证实来自微阵列上调的miRNAs。n=6

　　(C)典型的Northern印迹显示miR-223在横行主动脉缩窄或假治疗4周的小鼠心脏样本中表达。n=12(上部面板)。

　　(D)用血红素和曙红染色的全心切片显示miR-223转基因小鼠的扩张性肥大(bar=2mm)。

　　(E)8周龄野生型和miR-223转基因小鼠(TG)的心脏重量/体重比。n=18。

　　(F)野生型和miR-223转基因小鼠心脏样本中指示基因的mRNA水平。n=6。

　　(G)用麦胚凝集素染色的左心室肌切片，以划定细胞边界(上图；bar=20mm)或Masson‘s三色染色，以检测miR-223转基因小鼠的纤维化(下图；bar=20 mm)。

　　(H-I)超声心动图测定8周龄野生型和miR-223转基因小鼠的左心室内径(n=8)和左室短轴缩短率(n=12)。

　　(J和K)miR-223敲除小鼠(miR-223敲除)对异丙肾上腺素输注表现出减少的肥大反应。野生型和miR-223基因敲除小鼠注入生理盐水或异丙肾上腺素。分析心脏/体重的比率(J)。n=8。

　　图2：miR-223诱导心肌细胞的肥大反应。

　　(A-D)强制表达miR-223诱导肥大反应。心肌细胞感染腺病毒miR-223或b-gal在MOI为80。感染48小时后，用定量逆转录聚合酶链反应(A)分析miR-223水平。通过肌节组织(B；bar=20 mm)，细胞表面积测量(C)和蛋白质/DNA比率(D)来评估肥大。n=4.。

　　(E)异丙肾上腺素处理诱导miR-223表达增加。定量逆转录聚合酶链反应显示miR-223在用异丙肾上腺素处理的心肌细胞中在特定时间表达。n=5。

　　(F)将miR-223拮抗剂(ANTA-223)及其阴性对照(ANTA-NC)转染心肌细胞。转染24h后，用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析miR-223的表达。n=4.。

　　(G和H)miR-223敲除减弱异丙肾上腺素治疗引起的肥大反应。将miR-223反义寡核苷酸及其阴性对照转染心肌细胞，然后用异丙肾上腺素处理。治疗24小时后，通过细胞表面积(G)和蛋白质/DNA比率(H)评估肥大。n=5。

　　图3：在体内，心脏相关的circRNA与miR-223结合。

　　(A)差异引物扩增cDNA中的circRNA，而不是基因组DNA(GDNA)。GAPDH，线性控制。

　　(B)定量逆转录聚合酶链反应显示生理盐水与异丙肾上腺素灌注小鼠心脏样本中与心脏相关的circRNA表达。n=7。

　　(C)定量逆转录聚合酶链反应显示心脏相关circRNA在横行主动脉缩窄或假治疗4周的小鼠心脏样本中的表达。n=8。

　　(D)Northern blotting检测圆形但不是线性的心脏相关circRNA。

　　心脏：来自小鼠的心脏总RNA

　　CMC：心肌细胞RNA

　　T-L-HRCR：体外转录，线性HRCR RNA

　　CIRC-P：从头到尾探针

　　线-P：剪接位点内的探针

　　(E)如生物信息学程序RNAHybrid(上图)所分析的，与心脏相关的circRNA包含miR-223的6个互补位点。

　　(F)将生物素化的野生型miR-223(Bio-223-wt)或其突变体(Bio-223-mut)转染到心肌细胞中。

　　(G)从转染miR-223或miR-223突变体的心肌细胞中免疫沉淀AGO2。

　　(H)miR-223与心脏相关的circRNA相关。MIR-223被心脏相关的circRNA探针或随机探针拉下。Northern印迹分析MIR-223水平。

　　I：输入(10%样品加载)

　　P：颗粒(100%样品加载)

　　(I)荧光原位杂交实验表明，与心脏相关的circRNA可以与miR-223共定位。心脏相关的circRNA和miR-223探针分别用异硫氰酸荧光素和四甲基罗丹明标记。比例尺，10 mm。

　　图4：心脏相关的circRNA通过靶向miR-223和具有CARD结构域的凋亡抑制因子来调节心肌细胞肥大。

　　(A)从感染有空载体(EV)、HRCR-ir或与心脏相关的circRNA的腺病毒感染的心肌细胞中用10 mg RNA进行Northern印迹。针对心脏相关的circRNA和18S核糖体RNA(负载对照)进行印迹检测。

　　(B)心肌细胞如上所述处理，并通过定量逆转录聚合酶链反应分析心脏相关的circRNA水平。n=5。

　　(C)心脏相关circRNA的增强表达诱导具有CARD结构域水平的凋亡抑制因子的增加。

　　(D)心脏相关circRNA的敲除降低了具有CARD结构域的凋亡抑制因子的表达水平。

　　(E)心脏相关的circRNA可抵消miR-223对具有CARD结构域表达的凋亡抑制因子的抑制作用。

　　(F)心脏相关的circRNA可抵消miR-223对具有CARD结构域活性的凋亡抑制因子的抑制作用。

　　(G和H)心脏相关的circRNA减少异丙肾上腺素治疗引起的肥大反应。

　　(I)具有CARD结构域的凋亡抑制因子的敲除减弱了心脏相关circRNA对肥大的抑制作用。

　　图5：心脏相关的circRNA在体内调节心肌肥大和心力衰竭。

　　(A-C)心脏相关的circRNA抑制异丙肾上腺素治疗后的心肌肥大。传递与心脏相关的circRNA或与心脏相关的circRNA-ir和异丙肾上腺素治疗的腺病毒构建体的传递，如方法一节所述。

　　(D)心脏相关的circRNA减少异丙肾上腺素诱导的间质纤维化。

　　(E和F)心脏相关的circRNA改善心脏功能。小鼠按(D)中所述进行处理。超声心动图分析显示心脏相关circRNA处理的小鼠(F)左心室壁厚度(E)减少，缩短率增加(F)。n=8。

　　结论

　　这些发现揭示了一个由HRCR，miR-223和ARC组成的新的调节途径。调节它们的水平为治疗心肌肥大和心力衰竭提供了一个有吸引力的治疗靶点。