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反转录实验cDNA的合成(Cdna的合成过程)

2022-04-02 10:33:41
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  反转录实验过程看似简单的反转录实验,但也受到多种因素的影响,如模板、引物、酶以及反应条件等。

  模 板

  RNA自身结构、纯度和浓度的测定、完整度、gDNA的去除

  ① RNA自身结构(高GC、复杂二级结构)

  RNA由于自身序列折叠,具有不同复杂的二级结构:配对的双链RNA呈螺旋,发卡环,突环,内环,多分支环等结构。由于配对碱基不同,其配对的稳性也不同,如G与C之间的配对,三对氢键,最为稳定。A与U为两对氢键相互作用;G与U为一对氢键相互作用,最不稳定。故对于RNA模板来讲,GC含量越高,二级结构越为复杂。

  在进行反转录的过程中,当引物延伸到有二级结构的地方,反应就会被迫终止,影响cDNA的合成长度。此时可建议先将模板进行65℃孵育5 min然后迅速冰上冷却使二级结构变性;同时可通过在较高的温度下(如55℃)反应以降低RNA二级结构的形成。

  ②纯度和浓度的测定

  RNA纯度会很大程度地影响反转录实验,如RNA纯化过程中混入的盐、金属离子、乙醇、苯酚等均是常见的逆转录酶抑制剂。对于RNA纯度的测定,通常会选用Nano drop进行测定。纯度完好的RNA:1.8<OD260/OD280<2.0(<1.8时表明有蛋白质或酚污染,可增加酚抽提;>2.0时表明可能有异硫氰酸残存);OD260/OD230应大于2。(<2表明有异硫氰酸胍,β-巯基乙醇或乙醇的残留;可进行再次沉淀,重复乙醇洗涤)。

  ③完整度

  RNA的完整度在很大程度上影响着cDNA合成的长度与质量。在进行RNA提取处理储存和实验过程中需要采取特殊的保护措施,如操作者佩戴手套和口罩,全程使用无RNA酶污染的实验耗材等。对于下游的克隆实验,RNA完整度将会影响cDNA的合成长度,从而影响目的基因的合成。对于下游的目的基因定量实验,将会严重影响其CT值,从而影响定量结果精准度。

  ④gDNA的去除

  在进行下游qPCR实验过程中Totol RNA中混入的gDNA可直接作为PCR反应的模板进行扩增,造成实验结果的假阳性。因此在反转录之前必须要对RNA模板进行去gDNA处理,保证模板中仅有cDNA。可通过加入DNaseⅠ去除gDNA。但是在反转录实验前需将DNaseⅠ灭活(通过高温加热或加入EDTA),否则该酶会将cDNA降解,但是高温灭活DNaseⅠ会造成RNA的降解和损失,加入EDTA灭活又会引入新的RNA酶抑制剂。

  引 物

  Oligo(dT)、Random N6-N9、基因特异性引物

  ① Oligo(dT)

  Oligo(dT)引物是约12-18个多聚胸腺嘧啶T组成的重复寡核苷酸序列,能够特异性地与真核生物mRNA的ploy(A)尾退火,故不适合缺少ploy(A)尾结构的RNA,如原核生物RNA或microRNA,也不适用于已降解的RNA,如FFPE样品中RNA。

  真核生物中mRNA仅占总RNA的1%-5%左右,通常在进行从真核生物中构建cDNA文库,或者克隆全长cDNA以及3’RACE等研究时会优先选择 Oligo(dT)引物。

  对于复杂模板RNA,如含较多二级结构,在进行cDNA的合成延伸过程中,当延伸到二级结构处时,可能会造成延伸终止,若选择Oligo(dT)可能会造成mRNA 5’端信息的丢失。

  ②Random N6-N9

  随机引物是由随机碱基组成的寡核苷酸,通常由6个核苷酸组成,称为随机6聚体。该种引物不具备特异性,rRNA, tRNA,非编码RNA,小RNA,降解RNA,复杂二级结构的RNA等都可以作为其模板。该类引物可提高cDNA的产量和浓度,但是会使合成的cDNA长度变短。

  ③基因特异性引物

  基因特异性引物能够与模板特异性互补,产生目标性很强的cDNA,对于后续的PCR扩增更特异,适用于已知目的序列。通常应用于一步RT-PCR反应。当使用基因特异性引物(GSP)无法有效合成第一链cDNA时,可选用Oligo(dT)或随机引物。

  

  不同的逆转录酶具有不同的功能活性,表现出不同的逆转录效率,如合成cDNA的长度,产量,对复杂模板的适应程度等。

  1)RNA指导的DNA聚合酶活性:以RNA为模板,催化dNTP聚合形成DNA的过程。

  2)RNaseH活性:在反应过程中切割RNA:cDNA杂合链中的RNA模板。降低此活性,可避免在合成较长cDNA之前模板RNA被降解掉。

  3)DNA指导的DNA聚合酶活性:以反转录合成的第一条cDNA单链为模板,再合成第二条cDNA分子。

  4)热稳定性:此性能是影响cDNA合成的重要因素。升高反转录过程中的温度,有助于高GC或复杂二级结构RNA模板的变性,实现全长cDNA的合成。

  5)保真性:RNA反转录为cDNA过程中的序列精确度。由于逆转录酶不具备3’-5’外切酶活性,因此没有校正功能,所以合成的cDNA出错率较高。通常,除测序对精准度要求较高外,其他情况下,反转录中引入的错误数量可忽略不计,因为cDNA中的错误不会被放大。

  6)抗抑制能力:当模板纯度较低、抑制物较多时,抗抑制能力强的逆转录酶才能正常进行cDNA的合成。

  反应过程

  反转录温度通常推荐使用42℃,对于高GC含量模板或者复杂模板,可将反转录温度提高到50℃。反转录产物可立即用于qPCR反应,也可-20℃短期保存;若需长期保存,建议分装后,于-80℃保存,避免反复冻融。

  总之,高效率的逆转录反应建立在高质量的RNA模板、逆转录酶,合适的引物,适宜的反应条件等基础上的。实验过程中要注意到所有的影响因素,才能合成出适用于下游实验的高质量cDNA。

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