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细胞培养常见问题及解答(细胞培养会出现哪些问题)

发布时间:2022-03-29 10:32:35 阅读:12902次 来源:硕博实验中心

  1. 如何选用特殊细胞系培养基?

  培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。

  2. 何时须更换培养基?

  视细胞生长密度而定,或遵照细胞株基本数据上的更换时间,按时更换培养基即可。

  3. 可否使用与原先培养条件不同的培养基?

  不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基,若骤然使用和原先提供的培养条件不同的培养基,细胞大都无法立即适应,造成细胞无法存活。

  4. 可否使用与原先培养条件不同的血清种类?

  不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清,,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。

  5. 何谓FBS, FCS, CS, HS ?

  FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,两者都是指胎牛血清,乃错误的使用字眼,请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

  6. 培养细胞时应使用5% 或10% CO2?或根本没有影响?

  一般培养基中大都使用HCO3-/CO3 2-/H+ 作为pH 的缓冲系统,而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时,细胞培养时应使用10% CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时,则应使用5% CO2 培养细胞。

  7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?

  HBS和EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液,如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。

  8. 什么是细胞的接种密度?

  依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

  9. 悬浮性细胞应如何继代处理?

  一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,可将培养角瓶口端稍微抬高,直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞的培养液至另一新的培养角瓶,加入新鲜培养基稀释至适当浓度,重复前述步骤即可。

  10. 冷冻管应如何解冻?

  取出冷冻管后,须立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管之爆裂。

  11. 细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO?

  除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞),在解冻之后,应直接放入含有10-15 ml新鲜培养基的培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

  12. 附着性细胞继代时所使用的trypsin-EDTA 浓度?应如何处理?

  一般使用的trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于-20 ℃,避免反复冷冻解冻造成trypsin 的活性降低,并可减少污染的机会。

  13. 欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?

  回收动物细胞,其离心速率一般为300xg (约1 000 rpm),5-10 分钟,过高的转速,将造成细胞死亡。

  14. 细胞冷冻培养基的成份为何?

  动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能,故不可将DMSO 直接加入细胞液中,必须使用前先行配制完成。

  15. DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何?

  冷冻保存使用的DMSO 等级,必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即为无菌状况,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于4℃,避免反复冷冻解冻造成DMSO 的裂解而释出有害物质,并可减少污染的机会。若要过滤DMSO,则须使用耐DMSO 的Nylon 材质滤膜。

  16. 冷冻保存细胞的方法?

  冷冻保存方法一:冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ (-20℃ 30 分钟*) → -80℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

  冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降1-3 ℃至-80℃以下,再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20℃不可超过1 小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤,接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。

  17. 细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?

  冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial,融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

  18.培养基中是否须添加抗生素?

  除于特殊筛选系统中外,一般正常培养状态下,培养基中不应添加任何抗生素。

  19. 应如何避免细胞污染?

  细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和污染的细胞等。严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染的最好方法。

  20. 如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?

  原则上:直接灭菌后丢弃之。

  当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。

  高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

  (1)  在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。

  (2)  分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。

  (3)  每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。

  (4)  确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2~3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2~3代。

  (5)  在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

  (6)  重复步骤4。

  (7)  在无抗生素的培养基中培养4~6代,确定污染是否以已被消除。

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