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细胞瞬时转染和稳定转染步骤区别(在稳定转染和瞬时转染之间进行选择)

发布时间:2022-03-10 10:44:27 阅读:111392次 来源:百度学术

  哺乳动物和微生物细胞的稳定转染,以及随后用于大规模生产治疗性蛋白质的扩展,是一项标志性的生物加工操作。由于培养基和补料策略、过程分析/理解和单元操作优化方面的进步, 现在通常可以实现每升高达 10 克单克隆抗体 (mAb) 的特定滴度。

  稳定转染的主要缺点是需要时间。典型的分批补料培养会持续数周,并在此期间需要关注和资源。瞬时表达方案可在转染后 24 小时内提供蛋白质,这一时间框架可用于研究短期基因表达、RNA 干扰和基因沉默。最重要的是,瞬时表达使蛋白质迅速进入分析小组的手中,以进行早期表征研究。

  在决定瞬时转染和稳定转染时要考虑的其他因素:

  稳定转染

  仅使用 DNA 转染

  基因整合到基因组中

  需要选择性筛选

  低拷贝数整合

  可以使用诱导型启动子

  瞬时转染

  使用 DNA 或 RNA 转染剂

  未纳入基因组;每一代效果减半

  不需要选择性筛选

  相对较高的合并

  没有诱导型启动子

  多功能平台

  金斯瑞欧洲首席现场应用科学家徐树庭博士表示,除了广泛的治疗性蛋白质和 mAb 之外,瞬时表达还适用于快速生产先进的抗体衍生产品。

  “例子包括纳米抗体,它由与抗原结合的单域抗体片段组成,双特异性抗体是同时结合两种不同抗原或同一抗原上的两个表位的人造蛋白质。两者都可以通过瞬时或稳定表达来表达。”

  翻译后修饰 (PTM) 是当前备受关注的领域,因为它们对抗原性、循环半衰期和活性的潜在影响,无论蛋白质是通过稳定转染的细胞还是瞬时转染的细胞表达,都没有显着差异。“PTM 严格依赖于表达系统,即使用的细胞系,”Xu 补充道。PTM 几乎完全是表达系统的功能,而不是转染方法。

  徐解释说,当使用稳定转染的细胞时,表达产量或滴度通常更高,因为稳定表达的细胞系是根据它们的表达能力来选择的,当细胞传代和培养物扩大时,它们会传递给后代。“然而,借助先进的技术和表达平台,瞬时表达也可以达到非常高的表达产量。”

  据金斯瑞介绍,其 NextGen CHO 表达产品通过瞬时表达可达到 3 g/L。这些滴度是不久前稳定转染系统的上限,并且对于在分批补料系统中生产的某些蛋白质仍然被认为很高。

  一致性——连接发现和生产

  每个开发项目都专注于质量,这在与患者安全相同的对话中经常被提及。Xu 告诉 Biocompare,至少在理论上,通过瞬时转染细胞和稳定转染细胞表达的蛋白质之间的纯度/杂质谱应该没有太大差异,因为产品纯度取决于纯化方法。

  “然而,稳定的表达提供了更高的批次间一致性的好处。即使使用相同的质粒和相同的细胞系,瞬时生产的批次也会有所不同。这就是为什么当需要大量蛋白质时通常使用稳定表达,而在早期研究阶段首选瞬时表达,因为它的时间线更快,并且在修改目标蛋白设计方面具有灵活性。”

  只要有可能,蛋白质药物开发人员就会尝试使用相同的表达细胞进行瞬时和稳定的表达,以保持相似性并减少从发现到开发及以后的不确定性。这有助于保持目标蛋白质 PTM 的一致性,并且希望蛋白质功能也能保持一致。例如,金斯瑞的 NextGen CHO 平台允许从高通量表达筛选到稳定的细胞系生成,以达到克级甚至千克级的生产水平。

  尽管稳定表达和瞬时表达各有利弊,但没有“公式”或算法来选择使用哪一个。这两种方法都涉及将外来(目标)基因导入细胞。由于这种蛋白质制造能力会随着每次细胞分裂而稀释,因此当蛋白质需求较低时,或者当您的同事在“昨天”运行检测时需要材料时,瞬时转染可能是一种可行的方法。mAb 的瞬时基因表达在转染后需要 6 到 10 天,而来自稳定转染细胞的等价物则需要数周时间。“当使用廉价的高电荷阳离子聚合物聚乙烯亚胺作为转染试剂时,HEK293 细胞通常可以实现更高的转染率和更高的产量,”Xu 说。

  请注意,即使是稳定的转染在开始时也是一个短暂的过程,通过选择和扩增过程,出现稳定的克隆,其中基因成为宿主基因组的一部分,并随着细胞的扩增与细胞一起复制。

  “由于细胞的稳定转染是一个更长、更艰巨的过程,因此它是更大规模生产重组抗体的最实用方法,”徐解释说。“在最初的选择过程中,当研究量在 10 到 1000 mg 数量级就足够了,并且速度至关重要时,可以选择大规模瞬时表达。但对于治疗性抗体的大规模生产,稳定的基因表达是首选,因为它允许更高的工艺一致性和对最终产品质量的控制。”

  结论

  用于治疗性蛋白质发现和表征的瞬时蛋白质表达已经确立,全球对试剂和相关服务的需求估计超过 5.4 亿美元。领先企业包括 ProteoGenix、Absolute Antibody、赛默飞世尔科技、默克公司、龙沙集团、安捷伦科技、Takara Bio、Mirus Bio、Bio-Rad Laboratories、Qiagen、HiMedia Laboratories、Promega 和义翘神州。

  虽然瞬时表达的大多数新闻(和新产品)都涉及到像 CHO 或 HEK 这样的主力哺乳动物细胞系,但植物系统的转染也引起了人们的兴趣。在植物或植物培养物中生产有价值的蛋白质通常涉及基因表达,然后是标准的下游纯化。

  这种“分子农业”的几种产品现在已经商业化,这种方法似乎足够引人注目,但成功受到“低生产率、下游加工成本高以及造成翻译障碍的监管障碍所驱动的惯性”的限制。 ”

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/925.html

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