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成功进行活细胞成像实验的提示(活细胞成像实验步骤)

发布时间:2022-02-28 10:47:08 阅读:13102次 来源:本站

  在过去十年中,显微镜和相机技术以及标记感兴趣分子的技术取得了重大进展。这些进步导致活细胞成像在各个领域的普及,从基础研究到神经生物学、发育生物学、癌症研究和药物开发的高级研究。在这些领域中,活细胞成像可用于研究从整个生物体水平到分子水平的一段时间内发生的细胞过程。

  尽管活细胞成像有许多应用和许多不同的显微镜方法可以使用,但一个常见的挑战是在实验过程中保持样品完整性,同时获取足够分辨率的图像。这两个因素对于从活细胞成像实验中获得相关且可重复的数据至关重要。

  1. 准备样品时使用正确的培养基配方除了确保培养基配方含有适当的营养物质以促进细胞的生长和发育外,考虑 pH、缓冲能力和渗透压等因素对于成功进行活细胞成像实验至关重要。培养基 pH 值和渗透压(即培养基溶液中溶质的量)的变化会影响细胞的表达、它们的表型,并最终影响它们的外观和行为方式。调节和维持最佳环境条件将有助于防止对介质进行不必要的或有害的变化。

  此外,媒体中有很多因素会导致图像中的自发荧光我们的高背景信号。考虑使用无酚红培养基并降低血清浓度。这将大大降低背景信号。

  左图:用 straurosporine 处理 18 小时,然后用 EarlyTox™ Live Dead Assay – calcein AM(绿色)和 ethidium homodimer-III(红色)染色的 HeLa 细胞的 40X Plan Apo 图像

  右图:用异丙肾上腺素处理以刺激受体内化的 Transfluor U2OS 的 100X Plan Apo(空气)图像,通过 GFP 标记的 ß-arrestin(绿色)可视化。用 Hoechst 33342 核染料对细胞进行复染。

  2. 对样品进行成像时控制并保持适当的环境条件在整个活细胞成像实验过程中,为您的样品保持适当的环境条件非常重要。环境控制包括温度、湿度和气体(即氧气和二氧化碳)。

  调节和保持稳定温度的能力不仅可以保持细胞健康,还可以降低焦点漂移的风险。焦点漂移是随着时间的推移无法保持焦点。这通常是由于温度变化造成的,这会导致用于制造微孔板或其他培养容器的材料膨胀和收缩。为了进一步降低由于热波动而遇到焦点漂移的风险,请确保微孔板位于仪器台上或环境控制室中,以便在配置采集设置之前进行热平衡。此外,如果在延时实验期间必须将介质添加到孔中,请确保它与成像容器中的介质温度相同。板载流体控制选项,

  保持适当的湿度有助于防止培养基蒸发,特别是对于长期活细胞实验。蒸发会导致渗透压变化,这会对细胞的行为产生负面影响并影响您的分析。如果不能选择湿度控制,可以使用低渗(低溶质)溶液。

  控制二氧化碳水平也很重要,因为它有助于调节样品中的 pH 值。如果您无法控制二氧化碳水平,可以使用不同的合成缓冲液(例如 HEPES)来维持 pH 值。然而,在使用前应验证感兴趣的细胞和合成缓冲液之间的兼容性,因为合成缓冲液可能对许多细胞类型有害。如果细胞兼容,则应将 HEPES 用于持续数小时的短期研究,因为在 HEPES 缓冲培养基中长时间维持可能对细胞有害。

  保持适当的氧气水平也很重要,因为氧气需求可能会因细胞类型或特定活细胞实验的要求而有很大差异。

  ImageXpress® Pico 自动细胞成像系统和ImageXpress® Confocal HT.ai 高内涵成像系统等成像仪包括温度、湿度、氧气和二氧化碳的各种环境控制选项。因为这些成像仪可以与封闭的环境控制系统完全集成,所以板不会暴露在环境光和其他可能损害样品完整性的外部实验室条件下。此外,ImageXpress 系统的软件允许您在实验过程中通过环境控制传感器读数准确监测细胞环境。

  3. 在图像采集过程中使用强大的自动对焦模式我们的ImageXpress 系统设计有多种硬件(激光和 LED)和软件(基于图像)自动对焦模式,可让您在实验之间找到并保留焦点图像并最大限度地减少焦点漂移。自动对焦模式可以适应各种样品、培养容器厚度、物镜和成像参数。

  硬件自动对焦方法适用于大多数样本,并且与样本质量和亮度无关。硬件自动对焦允许更快的采集速度,从而最大限度地减少样品的光漂白。当样品的 Z 位置随时间或在整个板上发生变化时,添加软件自动对焦方法有助于在整个样品和实验室器具上提供可靠的对焦。对于大多数需要基于软件的对焦的情况,应同时启用硬件和软件自动对焦。硬件自动对焦将找到板底、孔底或两个表面。然后软件自动对焦将利用图像对比度来找到理想的焦平面。因此,样品应该明亮且没有碎屑,以便软件自动对焦以最佳方式工作。

  与硬件自动对焦相比,软件自动对焦会降低采集速度并存在光漂白样品的风险。为了缓解这种情况,应为正在获取的第一个通道启用软件自动对焦,并且可以将透射光用作该第一个通道而不是荧光通道。此外,减少曝光时间并使用更亮、更稳定的荧光团。分箱(见 #6)等工具也可用于帮助减少曝光时间。

  仅当没有为您的板配置硬件自动对焦、硬件自动对焦因板缺陷而失败、孔中体积小降低硬件自动对焦的可靠性或正在使用油浸物镜时,才应单独使用软件自动对焦方法。

  MetaXpress® 高内涵图像采集和分析软件使用户能够配置自动对焦设置以满足特定分析的需要。在单井中进行快速动力学延时实验时,可以将自动对焦应用于第一个时间点,只是为了提高采集率。对于长期延时实验或成像速率不重要时,可以在所有时间点设置自动对焦以减少焦点漂移。

  在CellReporterXpress® 图像采集和分析软件中,可以启用各种硬件和软件自动对焦例程。每个都是针对特定用例设计的,为各种样品提供无与伦比的聚焦选项。例如,Well Insert 硬件自动对焦例程检测三个峰(板底、孔底和孔插入),用于快速检测和优化包含三个不同表面的实验室器皿的聚焦。对于需要在低倍率下提高速度的采集,Anchor Focus Position 例程会保留选定的对焦 Z 位置,禁用自动对焦,并使用此保存的焦点位置获取图像。这在处理宏观样本(如整个生物体或组织)时特别有用。

  左:来自免疫肿瘤学检测的代表性 20X 共聚焦 2D 投影图像,显示小鼠结肠癌球体;由表达 GFP 的 MC38 细胞制成,用表达 RFP 的 T 细胞处理。

  右图:稳定转染以表达 RFP 的 Sigma U2OS 细胞的 4X 伤口愈合测定图像。

  4. 尽量减少照明光源的功率以及图像采集过程中的曝光时间照明光源的功率和曝光时间会导致细胞产生光毒性。即使是细胞的微小变化也会影响它们的行为或基因表达。因此,您需要找到合适的平衡点,这样您就可以在不将样品暴露在过多光线下的情况下获得高质量的图像。

  就光照而言,当荧光团或荧光分子处于激发态时,会产生自由基,自由基会对细胞造成DNA损伤和压力。光的强度越高,激发态越高,这会导致光毒性或对细胞造成损害。众所周知,紫外线 (UV) 具有更强的光毒性,因此与使用绿色或红色荧光团相比,使用 DAPI 等可激发荧光团可以产生更多的光毒性。

  对于荧光成像或多色成像,最好使用具有明显发射峰的光稳定、非常明亮、高信噪比的荧光团。这使您能够减少曝光时间。ImageXpress 系统包括有助于消除串扰的窄带通滤波器立方体。它还包括可以衰减和控制的大功率光源。例如,ImageXpress Confocal HT.ai 系统包括一个具有八个成像通道的七通道激光光源,以适应多色标记实验,如细胞绘画应用。

  高数值孔径 (NA) 物镜,例如水浸物镜,使您能够在更短的曝光时间内生成更亮、更高分辨率的图像。当使用高 NA 物镜时,最好使用薄塑料微孔板或培养皿(即具有盖玻片厚度的那些)。使用黑壁、透明底微孔板也是可取的,因为它们产生的自发荧光较少。

  5. 如果合适,在使用宽场显微镜系统时采用图像反卷积算法宽场显微镜系统,例如ImageXpress Pico 系统和ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System,是运行活细胞成像实验的最佳选择。为了提高这些系统的分辨率或灵敏度,可以使用图像反卷积算法。运行图像反卷积软件可减少采集过程中的失焦光,从而使您能够减少曝光时间并保持检测质量。但是,应该准确而仔细地应用反卷积,以免产生伪影。

  6. 使用允许使用高功率激光光源和分档的共焦成像系统ImageXpress Confocal HT.ai系统等共焦显微系统包括最适合用于对 3D 样品、厚样品或暗荧光团(例如,荧光标记的蛋白质)进行成像的激光光源。共焦仪器允许您调节和控制激光和 LED 光强度功率。

  在康宁 Elplasia 微腔板中生长并用不同浓度的星形孢菌素处理六天的 HCT116 球体的代表性 10X 计划 Apo 图像。球体用 Hoechst 33342(蓝色,细胞核)、钙黄绿素 AM(绿色,活细胞)和 ethidium homodimer-III(红色,死细胞)染色。

  Binning 是另一种可以在宽场或共焦成像时使用的工具,但在使用共焦仪器成像时,binning 的效果更加明显。因为旋转盘共焦系统的配置限制了照射到样品上的光量并阻挡了离焦的光,您通常必须使用更长的曝光时间或更高强度的光。Binning 通过组合来自相邻像素的电荷或强度信号并生成特定区域中像素强度的总和来减轻执行此操作的需要。这个总和给你更高的强度。从本质上讲,分箱增加了图像中的信噪比,从而允许您使用更短的曝光时间和更低的光强度。然而,这确实会降低空间分辨率。同样,这是在获取高质量图像和保持样本健康之间找到平衡的问题。

  7. 利用强大的分析软件获得可重复且有意义的数据 活细胞成像应用需要能够从大型且有时是复杂的图像和数据集中提取相关的大量定量数据。

  我们的MetaXpress和CellReporterXpress®软件等高内涵分析 (HCA) 解决方案包括强大的分析算法,可准确分割图像并生成可重现的数据。它们包括用于各种活细胞成像应用的预配置分析模块。可以使用MetaXpress 软件中的客户模块编辑器执行更多自定义分析。

  :用 Fucci 细胞周期传感器(GFP - geminin 和 RFP-Cdt-1)转染的 HeLa 细胞的 20X Plan Apo 图像。这张照片是在用细胞周期抑制剂诺考达唑治疗 13 小时后拍摄的。

  :从 MetaXpress 自定义模块分析生成的分析分割掩码。

  如果您希望获得有关正在研究的细胞的更深入信息,可以使用具有高级数据分析功能的机器学习算法。我们的IN Carta™ 图像分析软件包包含引导式机器学习工作流程,以提高分析准确性并对大量异质成像数据进行分类和比较。

  由于活细胞成像实验会产生大量数据,因此拥有足够的存储容量以及数据分析的处理能力至关重要。如前所述,合并可以减少图像数据大小并允许更快的数据传输速度,从而可以更快地分析图像。ImageXpress 系统还包括 MetaXpress® PowerCore™ 高内涵分布式图像分析软件,该软件利用并行处理显着提高分析速度。


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