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流式细胞仪的操作步骤(设计基本流式细胞仪面板的 10 个技巧)

发布时间:2022-02-25 10:24:01 阅读:110312次 来源:百度学术

  这十个技巧旨在帮助您设计您的第一个基本多色流式细胞仪面板

  熟悉您的流式细胞仪。大多数新的细胞仪将配备三个或更多激光器(激光器:紫色、蓝色和红色)。黄色激光很少见,主要用于检测细菌或酵母中的荧光蛋白,例如 GFP。

  一旦您了解了流式细胞仪的设置,就可以确定您的具体配置(例如,流式细胞仪中包含哪些检测器)。这些与激光一起提供了可以同时检测到哪些颜色和多少种颜色的信息(对于新的细胞仪,这将是五个或更多)。

  选择最亮的荧光染料。为了评估荧光染料的亮度,应查阅染色指数表。染色指数越高,荧光染料越亮。在市场上所有可用的荧光染料中,PE 是迄今为止最亮的。

  如果两种荧光染料的发射光谱重叠,则可能会观察到一种荧光染料溢出到另一种荧光染料的检测通道中。这使得观察离散细胞群变得困难或有时不可能。因此,在选择荧光染料时,应在光谱查看器的帮助下检查发射光谱和激发光谱是否存在光谱重叠。理想情况下,荧光染料之间不应有重叠。然而,在某种程度上,溢出可以通过一种称为补偿的技术来纠正。PE 和 FITC 在同一面板中使用时是两种荧光染料,需要进行补偿。

  在为您的实验选择了荧光染料后,您必须决定使用哪种荧光染料检测哪种抗原。应保留最亮的荧光染料以检测表达水平最低的抗原。最暗的荧光染料应用于检测最丰富的抗原。

  在设计≥8 种颜色的面板时,必须包括串联染料,例如 APC-Cy™7。这是由于激光激发和单一荧光染料的限制,这使得单个激光器必须激发尽可能多的荧光染料。

  由于细胞内存在生物素,因此应避免使用生物素偶联物对细胞内抗原进行染色。如果必须使用生物素,则在添加生物素化抗体之前,必须用未偶联的链霉亲和素封闭内源性生物素。

  许多细胞类型(例如 B 细胞、NK 细胞和巨噬细胞)在其表面具有 FcR 受体,抗体的 Fc 区与这些受体非特异性结合。这种结合将导致人工阳性染色结果,这可以通过用 FcR 阻断剂阻断受体来避免

  在流程面板中包含适当的控件。对于表面染色,同型对照仍然被认为是生成出版质量数据的必要条件。

  除了同种型对照外,未染色的细胞应始终包含在实验装置中以监测自发荧光。此外,对于所有多色流式细胞术实验,建议包括补偿控制和荧光减一 (FMO) 控制,这有助于识别门控边界。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/868.html

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