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细胞的稳定转染(稳定转染实验流程)

2022-02-17 10:30:36
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  稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上,使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株,稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株,同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。

  稳定转染实验流程

  从实验流程的角度看,稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的:先对哺乳动物细胞进行转染,再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。在建立稳定转染细胞系时,我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染,通常质粒中带有选择标记,选择标记会与目的基因共表达,由此可以筛选出阳性克隆(外源基因已稳定整合至细胞的基因组上),同时剔除未稳定整合的细胞。最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。

  细胞复苏

哺乳动物细胞稳转株构建流程

  细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程,将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。细胞复苏的关键是快融,防止在解冻过程中,产生的水珠形成冰晶损伤细胞。

  载体构建及细胞转染

  将目的基因构建至载体(载体需带有抗性),随后将构建好的质粒线性化。接着进行细胞转染,用于转染细胞的方式有多种,包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等,在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。

  细胞池筛选

  转染结束后即可得到细胞池,想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选:先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆,再用有限稀释法挑取单克隆株。另外如果想要得到高表达的稳定细胞株,需要对细胞池进行压力筛选(GS筛选系统或DHFR筛选系统),最终得到表达能力高的稳转细胞株。

  稳定转染实验影响因素

  外源基因整合几率:外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度;

  拷贝数:一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰;

  结合位点:不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性,有些区域易发生重组或者丢失,从而使稳转株筛选后出现丢失的现象;

  整合位点转录活跃度:整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量;

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