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酵母人工染色体的应用(酵母染色的原理和步骤)

2022-01-22 10:19:08
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  酵母人工染色体 (YAC) 是源自酵母 DNA 的基因工程染色体。

  它是一种人工设计的 DNA 分子,用于克隆酵母细胞中的 DNA 序列。

  它们是重组 DNA 克隆方法的产物,用于在酵母宿主中分离和繁殖非常大的DNA片段。

  通过插入大的 DNA 片段,插入的序列可以被克隆并使用称为染色体行走的过程进行物理映射。

  可以克隆到 YAC 中的 DNA 量平均为 200 到 500 kb。

  但是,最多可以将 1 Mb(兆,106)克隆到 YAC 中。

酵母人工染色体的应用(酵母染色的原理和步骤)

  酵母人工染色体的结构

  酵母人工染色体克隆载体由酵母端粒序列的两个拷贝(端粒是染色体末端的序列)、酵母着丝粒、酵母ars(DNA复制开始的自主复制序列)和适当的选择标记组成。

  酵母人工染色体的工作原理

  酵母人工染色体,通常简称为 YAC,是一种人工构建的系统,可以进行复制。YAC 的设计允许插入非常大的遗传物质片段。在称为克隆的遗传过程中,随后的几轮复制会产生许多插入序列的拷贝。

  原理与质粒或粘粒相似。

  实验者介绍了正确复制所必需的一些典型元素。

  对于 YAC,复制起点是酵母染色体的着丝粒和端粒,它们必须插入到被克隆的 DNA 中。

  构建体可以在酵母球状体中转化,然后在那里复制。

  与向量相反,YAC 不是圆形的。它们由线性 DNA 组成。

酵母人工染色体

  酵母人工染色体的过程

  YAC 载体最初利用细菌 ori 序列作为环状质粒在细菌宿主内繁殖。

  使用限制性内切酶在特定位点切割环状质粒,生成末端有两个端粒位点的线性染色体。

  线性染色体在具有不同选择标记的两个臂的特定位点再次被消化。

  然后使用 DNA 连接酶将基因组插入片段连接到 YAC 载体中。

  将重组载体转化酵母细胞并筛选选择标记以获得重组菌落。

  酵母人工染色体的优势

  酵母人工染色体 (YAC) 提供了所有克隆系统中最大的插入容量。

  酵母表达载体,例如 YAC、YIP(酵母整合质粒)和 YEP(酵母游离质粒),比细菌人工染色体 (BAC) 具有优势。它们可用于表达需要翻译后修饰的真核蛋白。

  在真核生物酵母中进行克隆的一个主要优点是,许多在克隆到原核系统时不稳定、代表性不足或缺失的序列在 YAC 克隆中保持稳定和完整。

  可以将完整的 YAC 重新引入哺乳动物细胞,在哺乳动物细胞中表达引入的哺乳动物基因并用于研究基因在侧翼序列背景下的功能。

  酵母人工染色体的用途

  酵母人工染色体 (YAC) 最初是为了研究有丝分裂和减数分裂中的染色体行为而构建的,而不会出现操纵和破坏天然染色体的并发症。

  代表连续基因组 DNA (YAC contigs) 的 YAC 为人类、小鼠甚至拟南芥基因组提供了物理图谱框架。

  YAC 对于那些试图分析整个基因组的人来说非常受欢迎。

  酵母人工染色体的局限性

  在构建和使用 YAC 文库时遇到的一个问题是它们通常包含嵌合的克隆,即,包含来自基因组不同位置的单个克隆中的 DNA。

  YAC 克隆经常包含克隆 DNA 的缺失、重排或不连续片段。因此,必须仔细分析每个 YAC 克隆,以确保没有发生 DNA 重排。

  克隆效率低(每微克载体和插入DNA可得到约1000个克隆)。

  已发现 YAC 不如 BAC 稳定。

  从含有 YAC 的酵母克隆中分离出的 YAC DNA 的产量非常低。

  YAC DNA 仅占重组酵母细胞中总 DNA 的百分之几。甚至很难获得 1 μg 的 YAC DNA。

  YAC 的克隆过于复杂,无法由单独的研究人员进行。

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