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分子实验-石蜡切片免疫组化染色实验流程(免疫荧光染色方法)

发布时间:2022-01-07 10:18:39 阅读:117232次 来源:百度学术

  免疫组化的方法很多,新方法层出不穷,虽然这些方法各有其特色,但总的来说,只要应用恰当均可获得较为满意的结果。方法的选择并不是影响免疫组化结果的主要因素。

石蜡切片免疫组化染色实验流程

  1.石蜡切片脱蜡至水:(石蜡切片染色前应置 60℃ 1 小时) 。

  ① 二甲苯 、II,各 10 分钟。

  ② 梯度酒精:100%,2 分钟 95%,2 分钟 80%,2 分钟 70% 2 分钟。

  ③ 蒸馏水洗:5 分钟,2 次(置于摇床)。

  2.过氧化氢封闭内源性过氧化物酶:3%H2 O2 ,室温 10 分钟(避光) 。

  3.蒸馏水洗:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

  4.抗原修复:根据待检测的抗原,选择适当的方法。

  附:抗原修复液(10mMpH 6.0 枸橼酸钠缓冲液)的配制:① 储备液的配制:A 液:枸橼酸三钠- 2H2O 29.41g + 蒸馏水 1000ml;B 液:枸橼酸 21g + 蒸馏水 1000ml;② 工作液的配制:A 液 82ml+ B 液 18ml+ 蒸馏水 900ml

  抗原修复的方法: ① 高压锅处理技术:枸橼酸钠缓冲液(10mM,PH6.0),淹没切片,盖上锅盖,高压锅内煮沸,上汽 3 分钟后缓慢冷却(可用自来水在高 压锅外冲,以助冷却) 。②微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内,枸橼酸 钠缓冲液淹没切片,选择中高或高档,5 分钟;取出并补充已预热的 枸橼酸钠缓冲液; 再选择中高或高档,5分钟(.佳温度为 92 95℃)③ 酶消化处理。

  抗原修复的注意事项:① 组织不能干。 ② 选择抗原修复方法要因抗体而异。 ③ 该方法主要用于 10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。④ 抗原修复后至 DAB 显色的过程中,均需用 PBS 缓冲液。

  5.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

  6.正常血清封闭:从染片缸中取出切片,擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 (保持组织呈湿润状态,)滴加正常山羊或兔血清 (与第二抗 体 同源动物血清)处理,37℃,15 分钟。

  附:正常血清配制 ( 或按试剂盒规定的浓度配制):按 1:20比例,用 PBS 配制,每张切片需要量按 50μ+5μl (10%抛洒量) 计算。

  7.滴加第一抗体:用滤纸吸去血清,不洗,直接滴加第一抗体,37℃ 2 小时(也可置于 4℃冰箱过夜) 。

  8.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

  9.滴加生物素化的二抗,37℃,40 分钟。

  10.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

  11.滴加三抗 (SAB 复合物) ,37℃,40 分钟。

  12.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

  13.DAB 显色,镜下观察,适时终止(自来水冲终止) 。

  附:DAB 的配制① 储备液(DAB 25mg/ml)的配制:DAB 250mg + PBS 10ml,待完全溶解后分装成 1ml,100μl,50μl ,20μ l 等,-20℃,冻存。② 工作液:DAB 储备液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl

  14.自来水(细水)充分冲洗。

  15.苏木素复染,室温,30 秒,自来水冲洗。

  16.自来水冲洗返蓝,15 分钟。

  17.梯度酒精脱水:80%,2 分钟 95%,2 分钟 100%,2 次,5 分钟。

  18.二甲苯透明:I ,II (二甲苯)各 5 分钟

  19.封片:加拿大树胶(或中性树胶)封片。

染色

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法

  1、组织的采集、固定和保存:

  采取组织后,

  方法一:4%多聚甲醛(4%PFA)4°C 固定1小时(根据组织大小和致密程度调整固定时间)或过夜

  方法二:采用bouin’s固定RT 2h(6-8d tesis)or RT 过夜(成年 tesis)

  PBS缓冲液洗三次,每次5min,4°C保存于70%乙醇中。

  2、组织的包埋、切片、展片及保存::

  固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,52-54°C石蜡包埋,常规切片,切片厚4 -10mm,贴于处理过的干净载玻片上,37°C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。

  石蜡包埋:

  保存于4°C 70%乙醇中的组织样品

  80%乙醇 15 min

  95%乙醇 15 min

  100%乙醇 15min ´ 2

  1/2乙醇1/2二甲苯 15 min

  二甲苯透明 5-10 min

  1/2二甲苯1/2石蜡 30 min

  石蜡(1) 1.5hr

  石蜡(2) 1.5-2.5hr

  石蜡(3) 包埋

  RT保存

  3、石蜡组织切片的免疫组化方法:

  密封保存于RT的组织切片

  二甲苯(1) 20 min

  二甲苯(2) 20 min

  100%乙醇 20min

  95%乙醇 10 min

  80%乙醇 10 min

  通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈

  切片在PBS中浸泡 5 min*2

  0.4%Tritonx RT 10 min

  切片在PBS中浸泡 5 min*3

  3%H2O2 RT 10min

  切片在PBS中浸泡 5 min*3

  0.25%胰酶 RT 10min

  切片在PBS中浸泡 5 min*3

  Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min

  倾去blocking buffer,勿洗

  一抗4°C overnight in blocking buffer

  取出切片复温1h,切片在PBS中浸泡 5 min*3

  二抗in blocking buffer GAR1:200 (GAM1:100),RT 1h

  切片在PBS中浸泡 5 min*3

  DAB显色5-10min(50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2)

  如果是增强型DAB只要1min即可。

  切片浸入PBS终止显色,HE衬染1s,

  玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15min,肉眼看到淡淡的紫色即可停止。

  若颜色太深,可用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1~2秒钟(或更久)

  脱水85%乙醇 5 min

  95%乙醇 5 min

  无水乙醇 5 min

  无水乙醇 5min

  二甲苯(1) 10min

  二甲苯(2) 10min

  中性树胶封片,室温干燥保存

  4、石蜡组织切片的免疫荧光方法:

  密封保存于RT的组织切片

  二甲苯(1) 20 min

  二甲苯(2) 20 min

  100%乙醇 20min

  95%乙醇 10 min

  80%乙醇 10 min

  通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈

  切片在PBS中浸泡 5 min*2

  0.4%Tritonx RT 10 min

  切片在PBS中浸泡 5 min*3

  切片在PBS中浸泡 5 min*3

  0.25%胰酶 RT 10min

  切片在PBS中浸泡 5 min*3

  Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min

  倾去blocking buffer,勿洗

  一抗4°C overnight in blocking buffer

  取出切片复温1h,切片在PBS中浸泡 5 min*3

  荧光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1:1000,GAM-488 1:1000RT 1h

  DAPI(1:1000请根据二抗说明稀释二抗)

  切片在PBS中浸泡 5 min*3

  moil封片,避光4°C保存


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/664.html

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