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分子实验外包-免疫组化实验中常见技术问题解答

2021-12-21 10:22:38
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  本文主要关于“免疫组化实验中常见技术问题解答”,针对部分问题进行总结与归纳,希望能够帮助到你。

  1、石蜡切片和冰冻切片的比较?

  (1)要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片,这是今天我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片,可能会破坏组织的抗原性,如果组织的抗原性较稳定,则可作石蜡切片;但是要求做石蜡切片的,可作冰冻切片。

  (2)冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性,做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构,可能会使抗原弥散;切片厚度较石蜡的厚,做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时,目录上都写着做什么样的切片,如果它写着只能做冰冻,就不能做石蜡,如写着两者都可,那就都能做。

  (3)石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构,且容易存放在室温,而冰冻切片比较麻烦,一定要存在-80度的低温冰箱中,尤其是用来做原位杂交的的切片,为了防止RNA降解,保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到4微米左右,所以原位杂交探针容易渗透到组织中去,容易成功,而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。

  2、一抗的选择要点和技巧是什么?

  (1)单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合,就像地命中目标一样。另一方面,即使是同一个抗原决定簇,在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体,形成好几种单克隆抗体混杂物,称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中,一般单克隆抗体特异性强,但亲和力相对小,检测抗原灵敏度相对就低;而多克隆抗体特异性稍弱,但抗体的亲和力强,灵敏度高,但易出现非特异性染色(可以通过封闭等避免)。

  (2)应用范围的选择。有的一抗只能用于Western Blotting,或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等;甚至表明石蜡切片或冰冻切片。

  (3)种属反应性的选择(species reactivity)。这一点很重要,表明这种抗体可能存在种属差异,且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。

  (4)种属来源,一般兔来源的多是多克隆;而小鼠来源的多是单克隆,但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。

  (5)生产厂家的选择。如santa Cruz公司抗体一般1ml,价格2100元左右;而chemicon公司一抗一般100ul,价格2800元左右。这两个厂家的同一种抗体它的实际效价稳定是不同的,我一般用后者抗体做免疫组化效果较好,而前者做Western blotting效果还可以。

  3、在什么情况下使用Triton-X100

  (1)Triton X-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚,是一种去污剂。在免疫组织化学(>10um厚切片) 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂,在膜上打孔。

  (2)其作用原理:Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内,故在细胞免疫组化时尤为推荐使用,这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。

  (3)Triton X-100既是一种表面活性剂,也有抗氧化作用。

实验器材

  4、封闭血清的选择原则是什么?

  (1)膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体,造成后续结果的假阳性!

  (2)封闭血清一般是和二抗同一来源的,血清中动物自身的抗体,预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合,否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合,会造成背景。

  (3)也可以用小牛血清、BSA、羊血清等,但不能与一抗来源一致。

  5、抗体孵育条件的比较?

  (1)一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度,其中4度效果;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般37度1-2h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。

  (2)二抗一般室温或37度30min-1h,具体时间需要摸索。

  6、一抗4度孵育后为什么要进行37度复温?

  (1)一方面,防止切片从4度直接放入PBS易脱片;

  (2)另一方面,使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

  (3)其实,我更赞同后一种说法,因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后,直接用PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩!

  7、DAB显色时间如何把握?

  (1)DAB显色时间不是固定的,主要由显微镜下控制显色时间,到出现浅棕色本底时即可冲洗;

  (2)DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色,这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长,需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间;

  (3)此外,若很短时间就出现背景很深,还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全,需要延长封闭时间;

  (4)DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色,一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短(一抗4度过夜);另一方面就是封闭时间过长。

  8、免疫组化结果如何分析?

  (1)阳性着色细胞计数法。在40*光镜下,随机选择不重叠的10个视野,人工或机器计数阳性着色细胞,每组3~6张不同动物组织切片,然后进行组间比较即可。

  (2)灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析,然后进行统计分析即可。

  (3)评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度(0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%),zui终可以分数相加,再进行比较。

  对于以上这几种方法,各有利弊,请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。

  9、在什么情况下进行组织抗原修复,抗原修复的条件是什么?

  (1)由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中,发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用,从而失去抗原性。通过抗原修复,使得细胞内抗原决定族重新暴露,提高抗原检测率。

  (2)修复方法从强到弱一般分为三种,高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种(具体的可以查阅相关资料,大量的:中性的、高pH的等)。

  (3)微波修复,我们一般用6min*4次,效果不错。

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