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分子实验外包-ELISA免疫组化控制方法(免疫组化实验步骤)

发布时间:2021-12-20 10:21:58 阅读:17342次 来源:百度学术

  接下来分享ELISA免疫组化控制方法及免疫组化实验步骤。

  一、非特异性染色的识别

  ELISA常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处,坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性,均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。

  二、非特异性染色的原因

  1. Ig与Fc受体结合

  ELISA多见于冰冻切片(特别是淋巴造血组织,淋巴细胞,单核细胞,组织细胞表面多),主要是和二抗反应,因为一抗一般稀释度均较大,因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体,所以石蜡切片不多见。

  避免方法:

  (1)用以二抗相同种族的正常血清封闭切片;

  (2)用不含Fc段的抗体,但价格贵。(V区,C1区不含Fc段,用Pepsin消化)

  2. 静电吸附

  抗体是一种带负电荷的球蛋白,容易和带正电荷的组织相结合,如胶原纤维。

  避免方法:

  (1)尽量稀释一抗;

  (2)降低抗体的电荷,如用2.5%NaCl,0.05mTBS代替PBS;

  (3)用去垢剂如triton-100,Tween-20等处理切片。

  3. 二抗与组织中的Ig结合

  如羊抗兔的二抗,二抗可以标本中(人)Ig发生交叉反应,科学上越接近的动物,交叉反应越明显,如人与猴,兔与豚鼠。

  避免方法:用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。如人血清。

  4. 组织中残存醛基与Ig的结合

  如醛类固定后未能彻底的冲洗,残留醛基可以和Ig结合。

  避免方法:

  (1)彻底冲洗;

  (2)0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗。

免疫组化实验图

  免疫组化实验方法

  即用型(Envision)快速酶免疫组化二步法链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结SP法卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物(SABC)法

  实验方法原理     根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚酶上形成多聚物分子,其与待检的抗原特异性的结合后,加入底物显色。

  实验材料    石蜡切

  试剂、试剂盒    PBS柠檬酸盐缓冲液蒸馏水增强剂酶标抗鼠 兔聚合物苏木素酒精二甲苯树胶盐酸二氨基联苯胺

  仪器、耗材    烘箱微波盒塑料切片架显微镜胶头滴管

  抗体    小鼠CDC2单克隆抗体

  IgG1, κ抗体

  IgG1, κ抗体

  免疫组化实验步骤

  1.  石蜡切片置于67℃烘箱中,烘片2小时,脱蜡至水,用pH7.4的PBS冲洗三次,每次3分钟(3×3’)。

  2.  取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液,加入微波盒中,微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档微波处理10分钟,取出微波盒流水自然泠却,从缓冲液中取出玻片,先用蒸馏水冲洗两次,之后用PBS冲洗2×3’。(注:不是所有的抗体都需要微波修复的,视具体情况而定)

  3.  每张切片加1滴3%H2O2,室温下孵育10分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。

  4.  除去PBS液,每张切片加1滴相应的*抗体(相应稀释倍数),室温下孵育2小时。

  5.  PBS冲洗3×5’。除去PBS液,每张切片加1滴聚合物增强剂,室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。

  6.  除去PBS液,每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物,室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’。

  7.  除去PBS液,每张切片加1滴新鲜配制的DAB液(二氨基联苯胺),显微镜下观察5分钟。

  8.  苏木素复染,0.1%HCl分化,自来水冲洗,蓝化,切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干后观察。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/560.html

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