接下来分享ELISA免疫组化控制方法及免疫组化实验步骤。

　　一、非特异性染色的识别

　　ELISA常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性，均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。

　　二、非特异性染色的原因

　　1. Ig与Fc受体结合

　　ELISA多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋巴细胞，单核细胞，组织细胞表面多），主要是和二抗反应，因为一抗一般稀释度均较大，因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体，所以石蜡切片不多见。

　　避免方法：

　　（1）用以二抗相同种族的正常血清封闭切片；

　　（2）用不含Fc段的抗体，但价格贵。（V区，C1区不含Fc段，用Pepsin消化）

　　2. 静电吸附

　　抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合，如胶原纤维。

　　避免方法：

　　（1）尽量稀释一抗；

　　（2）降低抗体的电荷，如用2.5%NaCl，0.05mTBS代替PBS；

　　（3）用去垢剂如triton-100，Tween-20等处理切片。

　　3. 二抗与组织中的Ig结合

　　如羊抗兔的二抗，二抗可以标本中（人）Ig发生交叉反应，科学上越接近的动物，交叉反应越明显，如人与猴，兔与豚鼠。

　　避免方法：用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。如人血清。

　　4. 组织中残存醛基与Ig的结合

　　如醛类固定后未能彻底的冲洗，残留醛基可以和Ig结合。

　　避免方法：

　　（1）彻底冲洗；

　　（2）0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗。

　　免疫组化实验方法

　　即用型(Envision)快速酶免疫组化二步法链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结SP法卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物（SABC）法

　　实验方法原理     根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚酶上形成多聚物分子,其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。

　　实验材料    石蜡切

　　试剂、试剂盒    PBS柠檬酸盐缓冲液蒸馏水增强剂酶标抗鼠 兔聚合物苏木素酒精二甲苯树胶盐酸二氨基联苯胺

　　仪器、耗材    烘箱微波盒塑料切片架显微镜胶头滴管

　　抗体    小鼠CDC2单克隆抗体

　　IgG1, κ抗体

　　IgG1, κ抗体

　　免疫组化实验步骤

　　1.  石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。

　　2.  取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3’。（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）

　　3.  每张切片加1滴3%H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。

　　4.  除去PBS液，每张切片加1滴相应的*抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。

　　5.  PBS冲洗3×5’。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。

　　6.  除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’。

　　7.  除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液（二氨基联苯胺），显微镜下观察5分钟。

　　8.  苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。