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分子实验外包-免疫荧光实验步骤(免疫荧光检测方法)

2021-12-17 10:29:45
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  免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原标记上荧光素,再用这种荧光抗体作为探针对抗原进行细胞定性和定位分析。由于其具有特异性强、敏感性高、速度快等优点,所以被广泛应用于科研领域。虽然这项技术并不复杂,但很多新生在着手实验时会遇到各种各样的问题,从而不能得到理想的实验结果。

  免疫荧光实验步骤

  1.合适的细胞密度

  首先细胞密度是试验成功的第一步,细胞密度太大,会造成细胞过于拥挤而边界不清晰,不仅细胞形态不佳且易导致染色背景深。同理细胞过少时不仅容易贴壁不好观察时不好找细胞,而且由于细胞过少可能活性不佳从而易发生非特异性荧光染色。不管是用六孔板还是共聚焦皿细胞密度以达到75%-85%最佳。

  2.细胞固定和通透

  固定剂的选择依赖于抗原的亚细胞定位(膜蛋白,可溶,细胞骨架相关蛋白等)。3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛是最常用的固定剂,适用于绝大多数蛋白。如果是研究膜蛋白的话,最好用3.7%-4%的甲醛。而研究细胞骨架成分可用甲醇固定法。固定后一般需要通透步骤,通透即是在膜上打孔,让抗体更易进入细胞与抗原结合。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透一般可以用0.1%-0.2%的Triton-X 100,而选择甲醇固定一般无需再通透,甲醇本身就有通透的作用。

  3.封闭条件的优化选择

  为了防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前用封闭液封闭,这样可以减少非特异性的背景着色。封闭液可以选择二抗来源一致的血清,一般来说,血清价格比较昂贵,可以用1%-5%BSA替代,BSA可以说是万能的封闭血清。另外封闭时间不易过长,30-60min即可,且封闭后不用洗涤,直接加一抗孵育即可。

  4.一抗二抗的选择

  封闭过后需要一抗孵育,可以选择4度过夜孵育或者室温3h,以笔者的经验是一抗孵育4度过夜比较好,抗原抗体结合会比较充分。一抗二抗的稀释比例可以根据抗体说明书来,再根据自己具体的实验要求进行优化。如果抗体浓度过低,会造成信号太弱,如果抗体浓度过高可能会造成背景染色太强。荧光二抗个人感觉Alex flour荧光基团信号强于Dylight强于FITC。如果做免疫双标,一抗要来自不同种属,荧光二抗的光谱也要分开。

  5.洗涤步骤

  免疫荧光过程中,有很多洗涤步骤,用PBS即可。在洗涤过程中,一要注意动作轻柔,固定后的细胞比较脆弱,如果太过大力,很容易把细胞吹洗掉,二是洗涤时间要把握好,每次洗涤5min左右,三是切忌不要干片,即吸掉溶液后不要把细胞干着,不然容易造成背景着色。

  以上总结免疫荧光步骤包括,细胞固定和通透,封闭,孵育一抗,二抗等。除了这些基本步骤,接下来的免疫荧光检测实验方法希望可以帮到您。

实验

  (免疫荧光检测方法)

  1. 细胞固定和通透

  为达到蕞佳的检测效果,细胞需要经过固定和通透。步骤很重要,细胞和抗原需要保证蕞佳的结构,并利于抗体与抗原结合。通常情况下,

  2. 抗体特异性

  免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体,可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下,纯化抗体的效果很好,但是正确的对照可以帮助精-准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照,有利于减少降低背景干扰。

  3. 合适的抗体稀释比例

  通过优化抗体稀释比例来优化染色,通常情况下 1ug/ml 的纯化抗体或者 1:100-1:1000 的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下,可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第1次使用该抗体或测定某抗原,强烈建议浓度梯度实验。

  4. 优化缓冲液和封闭剂

  尽管很多抗原在常见的 Buffer 如 PBS 中可以很好的被染色,但是对于某些目的抗原,更换一下含有不同离子的缓冲液,比如钙、镁、钾等,可以带来很大程度上的改善。Rockland 可提供优化过的 IHC 用封闭缓冲液,同样适用于荧光染色实验。

  5. 选择正确的二抗

  如果您需要做免疫实验,我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验;如果是双重甚至是多重染色,那么必须使用预吸附的二抗。同时,请优先选择来自同一物种的二抗。

  6. 使用合适的细胞密度

  选择合适的细胞数量进行染色,当细胞数量过多时,细胞结构不好,导致染色背景深,低细胞密度,会使细胞贴壁不佳,状态不好。

  7. 多重染色

  对同一样本进行两个不同抗原的检测时,可以用各自的抗体进行同时染色,但要求两个一抗的种属来源不同,标记物不同,而二抗的种属来源需保持一致。

  8. 降低背景

  高背景是免疫荧光常见的问题,解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替 BSA 做封闭液,降低抗体浓度,增加洗涤次数,洗涤至少三次,每次五分钟,推荐洗涤液为 PBS+0.05%Tween。

  9. 封片

  作为免疫荧光的蕞后一步,可以提高折射率,保护样品。

  10. 数据分析

  观察整体样片时,选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。

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