免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原标记上荧光素，再用这种荧光抗体作为探针对抗原进行细胞定性和定位分析。由于其具有特异性强、敏感性高、速度快等优点，所以被广泛应用于科研领域。虽然这项技术并不复杂，但很多新生在着手实验时会遇到各种各样的问题，从而不能得到理想的实验结果。

　　免疫荧光实验步骤

　　1.合适的细胞密度

　　首先细胞密度是试验成功的第一步，细胞密度太大，会造成细胞过于拥挤而边界不清晰，不仅细胞形态不佳且易导致染色背景深。同理细胞过少时不仅容易贴壁不好观察时不好找细胞，而且由于细胞过少可能活性不佳从而易发生非特异性荧光染色。不管是用六孔板还是共聚焦皿细胞密度以达到75%-85%最佳。

　　2.细胞固定和通透

　　固定剂的选择依赖于抗原的亚细胞定位（膜蛋白，可溶，细胞骨架相关蛋白等）。3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛是最常用的固定剂，适用于绝大多数蛋白。如果是研究膜蛋白的话，最好用3.7%-4%的甲醛。而研究细胞骨架成分可用甲醇固定法。固定后一般需要通透步骤，通透即是在膜上打孔，让抗体更易进入细胞与抗原结合。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透一般可以用0.1%-0.2%的Triton-X 100，而选择甲醇固定一般无需再通透，甲醇本身就有通透的作用。

　　3.封闭条件的优化选择

　　为了防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前用封闭液封闭，这样可以减少非特异性的背景着色。封闭液可以选择二抗来源一致的血清，一般来说，血清价格比较昂贵，可以用1%-5%BSA替代，BSA可以说是万能的封闭血清。另外封闭时间不易过长，30-60min即可，且封闭后不用洗涤，直接加一抗孵育即可。

　　4.一抗二抗的选择

　　封闭过后需要一抗孵育，可以选择4度过夜孵育或者室温3h，以笔者的经验是一抗孵育4度过夜比较好，抗原抗体结合会比较充分。一抗二抗的稀释比例可以根据抗体说明书来，再根据自己具体的实验要求进行优化。如果抗体浓度过低，会造成信号太弱，如果抗体浓度过高可能会造成背景染色太强。荧光二抗个人感觉Alex flour荧光基团信号强于Dylight强于FITC。如果做免疫双标，一抗要来自不同种属，荧光二抗的光谱也要分开。

　　5.洗涤步骤

　　免疫荧光过程中，有很多洗涤步骤，用PBS即可。在洗涤过程中，一要注意动作轻柔，固定后的细胞比较脆弱，如果太过大力，很容易把细胞吹洗掉，二是洗涤时间要把握好，每次洗涤5min左右，三是切忌不要干片，即吸掉溶液后不要把细胞干着，不然容易造成背景着色。

　　以上总结免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。除了这些基本步骤，接下来的免疫荧光检测实验方法希望可以帮到您。

　　（免疫荧光检测方法）

　　1. 细胞固定和通透

　　为达到蕞佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。步骤很重要，细胞和抗原需要保证蕞佳的结构，并利于抗体与抗原结合。通常情况下，

　　2. 抗体特异性

　　免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精-准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。

　　3. 合适的抗体稀释比例

　　通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下 1ug/ml 的纯化抗体或者 1:100-1:1000 的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第1次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。

　　4. 优化缓冲液和封闭剂

　　尽管很多抗原在常见的 Buffer 如 PBS 中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。Rockland 可提供优化过的 IHC 用封闭缓冲液，同样适用于荧光染色实验。

　　5. 选择正确的二抗

　　如果您需要做免疫实验，我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验；如果是双重甚至是多重染色，那么必须使用预吸附的二抗。同时，请优先选择来自同一物种的二抗。

　　6. 使用合适的细胞密度

　　选择合适的细胞数量进行染色，当细胞数量过多时，细胞结构不好，导致染色背景深，低细胞密度，会使细胞贴壁不佳，状态不好。

　　7. 多重染色

　　对同一样本进行两个不同抗原的检测时，可以用各自的抗体进行同时染色，但要求两个一抗的种属来源不同，标记物不同，而二抗的种属来源需保持一致。

　　8. 降低背景

　　高背景是免疫荧光常见的问题，解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替 BSA 做封闭液，降低抗体浓度，增加洗涤次数，洗涤至少三次，每次五分钟，推荐洗涤液为 PBS+0.05%Tween。

　　9. 封片

　　作为免疫荧光的蕞后一步，可以提高折射率，保护样品。

　　10. 数据分析

　　观察整体样片时，选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。