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细胞实验外包-细胞增殖检测方法(细胞增殖包括什么过程)

发布时间:2021-11-30 10:44:27 阅读:16762次 来源:百度学术

  细胞增殖是生物体的重要生命特征。细胞在辐照等外界刺激或给药处理的情况下,会产生细胞毒作用,其生长情况会受到影响,同时,细胞的活性也会受到相应的影响。检测细胞增殖及活性变化情况则可以很好的反映细胞的生长状态及外界刺激的细胞毒作用情况。细胞增殖的研究方法有很多,以下内容为细胞增殖检测方法的总结。

  一、分子水平

  研究细胞增殖的另一种方法是观察增殖细胞中表达但非增殖细胞中不存在的特定蛋白质。抗增殖期间表达抗原通常在除G0以外的所有细胞周期阶段在核周或核内部区域表达,因此是最佳增殖细胞标志物。相关的蛋白包括:Ki67,PCNA ,MCM-2。

  Ki-67

  Ki-67(也称为mki67和TSG126)是一个350-370kDa的核蛋白,属于一个由有丝分裂染色体相关蛋白组成的分子组。Ki67最初被认为是与抗霍奇金淋巴瘤核物质的单克隆抗体Ki67相关的抗原。可以在细胞周期中不处于Go阶段的所有细胞中发现。因此Ki67可以作为细胞增殖标记物。

  PCNA

  PCNA(增殖细胞核抗原)是一种分子量为36kDa的蛋白质,在细胞核内合成,并存在于细胞核内,在细胞增殖的启动上起重要作用,是反应细胞增殖状态的良好指标,但多项研究表明,评估不同来源肿瘤中的细胞增殖时,Ki-67 的敏感性和特异性更高。

pcna

  MCM 2-7complex

  MCM2-7(MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6、 MCM7)蛋白六聚体是较早被发现的MCM蛋白功能复合体。复合体中MCM蛋白的特殊结构是实现核-膜穿梭和磷酸化激活的基础。MCM2—7进入S期和细胞分裂所必需的。并且参与耳蜗毛细胞的晚期分化发育,诱导细胞凋亡。MCM2-7标志物日益受到关注,最新研究表明,相较 Ki-67 和 PCNA,MCM2-7可能是了解癌症预后的更好选择。

  二、细胞水平

  全球肿瘤发病率和死亡率近年来持续上升,癌症已经成为人类寿命的三大杀手之一,寻找更新更好的抗肿瘤药物成为全人类关注的热点问题之一。抗肿瘤药物的筛选体系复杂,涉及到宏观到微观水平的一系列实验,例如动物水平的筛选、细胞水平的筛选等。细胞水平的细胞增殖是生物医学领域非常重要的表型,对细胞增殖的检测是检验药物对肿瘤细胞影响的最主要检测手段。检测增殖状态常用的细胞水平检测包括:MTT、XTT、WST-1、CCK-8、Brdu染色法、Edu染色法、RTCA(real time cell analyzer)和细胞克隆形成实验等。其中MTT、XTT、WST-1、CCK-8都用于间接定量增殖(呼吸)细胞的生化测定。

  MTT法:

  MTT分析法以活细胞代谢物还原剂MTT(化学名:3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide)为基础。MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可以用DMSO来溶解,利用酶标仪测定570nm处的光密度OD值,以反映出活细胞数目。

  XTT法:

  XTT是MTT的衍生物,是一种黄色的四氮唑盐。当XTT与电子偶合剂吩嗪硫酸甲酯联合应用时,黄色XTT可以被细胞内的线粒体脱氢酶还原成水溶性的橙黄色甲臢产物,在450nm有最大吸收峰。这种水溶性的橙黄色甲臢产物与活细胞数成正比。

  WST-1法:

  WST-1是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。WST-1与MTT、XTT相比具有水溶性好,性质稳定,灵敏度高线性范围宽,毒性小等特点。

  CCK-8法:

  CCK-8试剂中含有WST-8(化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐),它在电子耦合试剂1-Methoxy PMS(1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。

cck-8法

  BrdU法:

  BrdU是胸腺嘧啶的衍生物,能与胸腺嘧啶竞争掺入的强溴脱氧尿嘧啶核苷形成DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物,通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期),活体注射或细胞培养加入,而后利用与Apollo荧光染料特异性反应检测细胞增殖情况。

  EdU法:

  EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物。它也能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性,通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。与传统的BrdU相比,EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500,因而在细胞内很容易扩散,无需DNA变性(酸解、热解、酶解等)即可有效检测,可有效避免样品损伤,在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。而BrdU需要变性DNA后才能与抗体结合,破坏了DNA双链结构,影响了Hochest等染色,导致染色弥散,准确性降低等问题,逐渐被EdU取代。

  RTCA实时无标记细胞分析技术

  该技术采用特殊工艺,将微电极列阵整合在细胞培养板的每个细胞生长孔底部,用以构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化改变的细胞阻抗检测传感系统。当贴壁生长在微电极表面的细胞引起贴壁电极界面阻抗的改变时,这种改变与细胞的实时功能状态改变呈相关性,通过实时动态的电极阻抗检测可以获得细胞生理功能相关的生物信息、包括细胞生长、伸展、形态变化、死亡和贴壁等。

软琼克隆形成实验

  细胞克隆形成实验

  细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的重要技术方法。当单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,成为集落或克隆。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测,细胞克隆形成率即细胞接种存活率,克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

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