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细胞实验-细胞凋亡实验原理及方法

2021-11-26 10:16:50
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  细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动的过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,它并不是病理条件下,自体损伤的一种现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

  凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守,如Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。随着分子生物学技术的发展,对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识,但是迄今为止凋亡过程确切的机制尚不完全清楚。凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系,如肿瘤和自身免疫性疾病等,能够诱发细胞凋亡的因素很多,如射线、药物等。

细胞凋亡

  技术原理

  磷脂酰丝氨酸(Phosphatidyl serine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS从细胞膜内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。

  碘化丙啶(Propidium,简称PI)是一种双链DNA荧光染料。PI和双链DNA结合后可以产生荧光,并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被PI染色后,可用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定,然后根据DNA含量的分布情况,进行细胞周期和细胞凋亡分析。PI染色后,假设G0/G1期细胞的荧光强度为1,那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2,正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组DNA片段在染色过程中丢失,因此凋亡细胞在PI染色后呈现明显的弱染,即荧光强度小于1,在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰,即凋亡细胞峰。

  细胞发生凋亡时,由于胞浆和染色质浓缩,核碎裂,产生凋亡小体,使细胞的光散射性质发生变化。在细胞凋亡早期,细胞对前向角光散射的能力显著降低,对侧向光散射的能力增加或没有变化。在细胞凋亡晚期,前向和侧向光散射的信号均降低。因此可通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化观察细胞凋亡情况。

细胞凋亡实验

  结果示例

细胞凋亡

  

  TUNEL法

  原理:DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3' -OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺末端标记法(TdT mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)。

  特点:

  能准确的反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片.冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞。

  Caspase-3活性检测法

  原理:Caspase-3的激活在凋亡过程的细胞事件启动中起着重要作用,运用荧光酶联免疫吸附法(flurometricimmunosorbent enzyme assay ,FIENA)的原理, Caspase-3激活后会作用于其特异的底物。

  特点:该方法可用于各种培养细胞凋亡诱导研究,而且灵敏度高,特异性强(特异性的抗caspase-3单克隆抗体),与其他已知的caspases无交叉反应。

  参考文献

  Safari, Fatemeh et al. “Caspase-7 deficiency in Chinese hamster ovary cells reduces cell proliferation and viability.” Biological research vol. 53,1 52. 13 Nov. 2020, doi:10.1186/s40659-020-00319-x

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