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细胞实验:细胞转移4个常见入门实验方法

发布时间:2021-11-21 10:40:38 阅读:14902次 来源:百度学术

  细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

  细胞划痕

  肿瘤细胞在体外仍具有迁移的能力,本实验借鉴体外细胞致伤愈合实验模型,利用细胞划痕法测定了肿瘤细胞的运动特性。

  细胞划痕实验方法:

  将细胞密度为5~10×105个/mL的XXX细胞铺于24孔板(每孔500 μL)上,加入含10%胎牛血清的RMPI.1640培养液,培养16~24h,使形成单层细胞。用10μL移液枪枪头(或者无菌牙签)在单层细胞上呈“一”字划痕,用PBS清洗3次,孵育24h后换成含10%胎牛血清的RMPI.1640培养液,孵育24h。观察并拍照:吸去培养液,用PBS清洗3次后,在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

  细胞粘附

  细胞粘附实验通常分为两类,即细胞与细胞粘附和细胞与基质粘附。机体内许多细胞,如上皮细胞固定在某处发挥功能;另一些细胞,如白细胞,活跃运动,就需要不断调节细胞粘附。细胞粘附性的改变在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用。恶性肿瘤具有从原发瘤分离及在体内扩散的能力,提示这些细胞相互识别及粘附机制发生了改变。

  细胞粘附实验方法:

  用10 μg/mL的纤连蛋白(fibronectin,FN)预铺96孔板,70 μL/孔,4℃过夜后,PBS洗3遍,再用1% BSA于37℃封闭1h,PBS洗3遍。将待测XXX细胞培养至对数生长期,消化细胞,用无血清培养基悬浮细胞,调整浓度为5×105/mL分别接种于预铺FN的96孔板中,每孔5000个细胞,每组设3个复孔。37℃孵育1h后,PBS洗去未黏附的细胞。

  检测方法1:3.5%戊二醛于4℃固定0.5h,PBS洗3遍;0.1%的结晶紫染色,室温静止0.5h,PBS洗3遍,每孔加入100 μL 10%的乙酸,5~10min后用酶标仪检测595nm的吸光度值,用以表示黏附细胞的多少。

  检测方法2:按照每孔加入100μL甲醇,固定15 min每孔加入100 μL吉姆萨染液,染色15min,PBS洗去染液倒置显微镜下随机取5个随机视野计数粘附细胞数量并拍照,统计结果。

  检测方法3:MTT法或CCK-8检测细胞量。

细胞转移实验

  Transwell迁移

  细胞迁移实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的XXX细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

  Transwell迁移实验方法:

  所有细胞培养试剂和Transwellchamber放在37℃温育。待测XXX细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗涤一次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度为2×105/mL。在下室(即24孔板底部)加入600-800μL含10%血清的培养基,上室加入100-150μL细胞悬液,继续在孵箱培养24小时。用镊子小心取出chamber,吸干上室液体,移到预先加入约800μL甲醇的孔中,室温固定30 min。取出chamber,吸干上室固定液,移到预先加入约800μL Giemsa染液的孔中,室温染色15-30 min。轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出chamber,吸去上室液体,用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞。用小镊子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片。显微镜下取9个随机视野计数,统计结果。

  Transwell侵袭

  所谓Transwell侵袭实验,其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验。

  Transwell侵袭实验方法:

  基质胶准备:将冻存于-80℃冰箱的BD matrigel 4℃过夜(24h),变成液态。取300μL无血清培养基,加入60μL(或50μg/每室)Matrigel,4℃混匀,加入上室各100μL(3个室),放入37℃培养箱中,孵育4-5h。当出现“白色层”时,说明已经变为固态。消化XXX细胞,无血清培养基洗3次,计数,配成细胞悬液。用无血清培养基洗Matrigel洗1次,每孔加入100μL细胞悬液。下腔室中加入500μL含有20%FBS条件培养基。37℃培养箱中,孵育20-24h。取出transwell用PBS洗2次,5%戊二醛4℃固定。加入0.1%结晶紫染色或Giemsa染色,室温染色5-10min,0.5h,PBS洗2次,用棉球擦去上表面细胞,显微镜下取9个随机视野计数,统计结果。

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