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实验外包:RT-PCR原理及应用

发布时间:2021-10-13 02:00:01 阅读:19192次 来源:本站

  RT-PCR的原理是提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。

  该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

  RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。 要求:

  1.做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng或1ug。

  2. RT按要求做,一般不会出太大问题。

  3. PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA存在,不是单改变Mg2 浓度、退火温度能解决的。

  RT-PCR技术操作步骤

  1、预变性:

  破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性,减少DNA 复杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组来源的DNA模板,最好不要吝啬这个步骤。此外,在一些使用热启动Taq酶的反应中,还可激活Taq酶,从而使PCR反应得以顺利进行。

rt-pcr原理

  2、变性--退火--延伸循环:

  ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;

  ②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

  ③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

  3、PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟。

  注意事项:

  1、合成cDNA的引物:合成cDNA引物时,通常采用随机六核苷酸引物能够有效地指导从RNA有效地合成第一链cDNA:

  2、避免RNA酶的污染:在合成cDNA第一链时,应使用RNA酶抑制剂,进行RT-PCR时,用于合成cDNA第一链的RNA不会对PCR有影响,因此没有必要用碱或RNA酶处理;

  3、不同来源的逆转录酶均可较好地用于第一链cDNA的合成,但不同来源的逆转录酶反应温度有所不同。如来自鸟类成髓细胞瘤病毒(AMV)与来自鼠白血病毒莫勒尼株(Mo-MLV)均可用于合成第一链cDNA,AMV要求的反转录温度为42℃,而Mo-MLV则要求37℃,相对而言,Mo-MLV比较适合于RT-PCR,但由于其作用的最适温度为37℃,较AMV的42℃低,因此,对于具有较高二级结构的RNA模板可能会带来不利的影响。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/390.html

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