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细胞实验:siRNA细胞转染步骤「实验要点」

发布时间:2021-09-24 03:13:35 阅读:111922次 来源:本站

  siRNA是一种小RNA分子(~21-25核苷酸),由Dicer(RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补的目标mRNA的沉默。下面以Entranster-R4000试剂为例,说一下siRNA转染步骤(24孔板),供大家参考学习!

  siRNA细胞转染步骤

  1.提前1天细胞种植

  贴壁细胞:提前一天将细胞种植在24孔板中,以转染时细胞汇合度(Confluence)在30%左右为宜,转染前全培养基总量为0.45ml。

  悬浮细胞:采用对数生长期的细胞,数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105,那么就用2×105的细胞进行转染。

  2.转染过程

  ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA,加入一定量无血清稀释液,充分混匀,制成RNA稀释液,终体积为25μl。

  注意:无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

  ⑵取1ul的EntransterTM-R4000,然后加入24ul无血清稀释液体,充分混匀,制成EntransterTM-R4000稀释液,终体积为25μl。室温静置5分钟。

细胞实验

  ⑶将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上)混合,室温静置15分钟。转染复合物制备完成。

  ⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基(可含10%血清和抗生素)的细胞上,前后移动培养皿,混合均匀。

  注意:对本试剂,采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

  ⑸转染后6小时观察细胞状态,如状态良好可不必更换培养基,继续培养24-96小时得到结果。

  siRNA细胞转染关键点

  1.设计合成有效的siRNA

  RNAi的核心需要siRNA对相应mRNA进行有效的结合和作用。siRNA的设计合成首先很重要,最优的设计可以用最小的工作浓度取得满意的沉 默效果,减少副反应的发生。siRNA的设计可以通过检索,优先选用经过验证的siRNA或设计多对siRNA。需要强调的是,需要同时设置阴性对照以排 除非特异沉默现象和阳性对照以确认整个实验体系的有效性。

  2.合成的siRNA注意纯度和工作浓度

  siRNA的合成需要注意的是一定要选用高纯度的siRNA,siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。siRNA的工作浓度和siRNA的设计、细胞种类、目标基因有关。建议一定进行相关的预实验优化各条件。

  3.选择合适的siRNA转染试剂

  选择合适的siRNA转染试剂是的RNAi实验成功另一个关键。由于细胞毒性对siRNA实验有很大影响,它直接影响实验的结论和结果,因此必须选择低毒性转染试剂,以观察转染试剂的毒性是否较低。有一个简单的方法,看转染的过程和要求,比如要求的细胞密度越大,说明毒性越大,例如转染复合物容许和细胞孵育的时间越短,说明毒性越大。除了低毒性,最好操作简便,例如有的转染试剂要求转染前换无血清培养基或低血清培养基,转染后又要有血清培养基。实际上,由于培养条件的频繁变化,可能会对细胞表达模式产生影响,对后续的mRNA和蛋白分析也同样产生影响,最终影响实验的可靠性。

  内容源自:百度学术

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/370.html

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