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动物实验:关于复发性口腔溃疡动物模型建立

发布时间:2021-09-13 02:20:19 阅读:114902次 来源:本站

  动物模型的建立是研究疾病病因、机制、转归及治疗等的重要方法和手段,国内外对口腔溃疡动物模型的建立做了大量的研究、探讨和论证1。目前常用的造模方法有化学灼烧法、免疫法、化疗法、氧自由基法、放射法、细菌感染诱导法等。由于该病病因尚不完全明确, 临床疗效不理想,临床上通常采用延长溃疡发生周期、缩短发病时间、全身用药以及局部对症治疗缓解疼痛,促进溃疡愈合,其发病机制至今仍未完全阐明。因此建立简单、实用、可靠的动物模型是深入研究口腔溃疡发病机制及评价临床药物疗效的重要方法,本文对口腔溃疡动物模型综述如下。

  1造模动物

  口腔溃疡中造模的动物通常选用兔(家兔,新西兰大白兔、青紫兰兔、日本大耳白兔等)与鼠(大鼠、裸鼠、豚鼠、金黄地鼠等)。

  2常见口腔溃疡模型

  2.1自身组织抗原免疫注射法:即弗氏佐剂+口腔黏膜组织法;在无菌环境中,予以生理盐水口腔黏膜内注射,剥离黏膜,生理盐水冲洗,在彻底研磨后加入0.1mL、 pH7.4的磷酸缓冲液(PBS),配制成组织匀浆,于-80℃低温冰箱保存备用。造免疫动物模型时,再加人等量的完全弗氏佐剂,用振荡器将二者充分混匀,待呈现乳状液后放置,并于不分层时再行注射。在大鼠脊柱的两侧予以上述组织乳化剂行皮内注射,每只注射2点,每点0. 1mL,1次/周×8次。也有从大鼠背部皮下注射抗原乳化剂,每两周注射1次,共注射5次。

  在抗原注射第3周时,大鼠两侧口腔的颊黏膜内呈现出不同程度的充血、红肿。注射抗原第4周后,大鼠开始出现口腔溃疡,但溃疡病灶较浅,主要分布于两颊及

  口屠黏膜,范围相对较广。随看机原社卖H的心周时,仍鼠口腔内不断出现新的充血址,注射抗原第8周时,仍

  然发现有新的溃疡病灶出现。病灶主要呈圆形或椭圆形,边缘较整齐,表面覆盖有一层黄白色或黄色假膜。其体征和组织病理学变化均近似于人类复发性口腔溃疡( recurrent oral ulcer,ROU) ,表现为非特异性炎症,可自动愈合,也可再次复发[2~]。免疫法建模与人类ROU的发作极其相似,尤其适用于免疫力低下引起的口腔溃疡。通过观察溃疡灶的愈合过程,从而为临床用药提供科学依据,但此法较复杂.耗时长,溃疡个数与部位不易掌控,不适合大规模动物实验。

动物实验

  2.2”化学物质烧灼法:化学烧灼物可采用10% /30%e/40%冰醋酸、90%石炭酸、90%苯酚等。方法一:用内径为0.6cm ,长 3cm 的玻璃制管,垂直固定在大鼠口腔黏膜表面,并向玻璃制管内注入0.2mL体积分数为30%的乙酸,维持30s后再用棉签蘸出乙酸。灼烧面于48h后,出现一直径约为3 ~5mm,深而大的溃疡病灶;同时大鼠伴有口唇肿胀、流口水、体重减轻,摄食量饮水量减少、活动减少等症状[2]。方法二:将塑料离心管底部磨出直径2mm的孔,用小棉球沾取90%石炭酸(湿润不溢出为度)至管内小孔处,用3%戊巴比妥钠对新西兰兔进行静脉麻醉,牵拉上下唇,暴露口腔颊部粘膜,将离心管垂直于左右两侧距口角1mm处的口腔粘膜表面,烧灼30s ,可见口腔粘膜苍白。第2d创面形成直径为2mm的圆形溃疡,表面充血,无伪膜,边界清晰。冰醋酸烧灼法不需麻醉,操作简便,用量准确,溃疡的部位、大小,深浅易控制,诱发的溃疡重复性好、成功率高,适合大规模的动物实验。其与体积分数90%的石炭酸相比较,化学性质较之稳定,且可操作性好,诱发的溃疡病灶相对恒定,可作为某些促进口腔黏膜愈合药物及抗炎药物的研究模型。但由于化学试剂接触粘膜后易扩散,从而导致粘膜受损面积扩大,被烧灼区域不易固定,溃疡大小不稳定。而且该溃疡是化学药品刺激性损伤导致的,在模拟人类RAU模型方面可能存在一定的局限性,如较难模拟人类RAU的复发性,因此该方法还有待改进。

  2.3组织剪切法:组织剪切法即通过外科手术直接剪取5mm口腔粘膜上皮组织造成外伤,创面为圆形或椭圆形,直径5 ~7mm ,深约1mm。第2d创面黄白色伪膜覆盖,形成溃疡面,周围粘膜充血水肿,形成创伤性溃疡5。创伤性口腔溃疡是指口腔内残根残冠、牙齿的锐利边缘、错位牙、不良修复体等长期慢性机械损伤形成的溃疡;或由长期咬腮、咬颊、咬唇等自伤性不良习惯造成的溃疡。溃疡的形状与刺激因子完全契合。但由于予以机械性剌激作用来造模的方式与其力量的大小及作用的时间长短不同,导致出现的病损各有特点。该方法是用机械方法制造动物口腔粘膜创伤性溃疡,溃疡大小.深度易于控制,可观察溃疡愈合的时间及面积大小,适用于某种方法治疗单纯创伤引起溃疡效果研究的筛选模型。

  2.4细菌诱导法:方法一:于豚鼠口腔颊部黏膜下注射15× 10*CFU/mL的表皮葡萄菌菌液0.07ml/只,24h后在原注射部位再加强注射等量菌液1次,注射量同前。在第1次注射48h后,形成的脓疤即自行溃破,形成溃疡6。方法二:于豚鼠口腔颊部黏膜下注射15 × 10*CFU/mL的白色念珠菌菌液0. 07mL/只,48h后注射部位形成溃疡?。这类造模方法主要用于观察溃疡的大小、愈合时间、炎症指数以及炎症消退时间等。此方法模拟细菌感染引起的溃疡,适用于研究某些药物对致病真菌引起口腔溃疡的作用,尤其是对于有消炎作用的药物,更能证明药物疗效。但该方法也容易引起合并感染。

  2.5氧自由基诱发法:选用金黄地鼠或wistar大鼠,乙醚吸入麻醉后,将0.25mL,5mmol/L甲基紫精( pa-raquat , PQ)溶液注人鼠颊囊的粘膜下层,24 ~72h 粘膜出现损害,粘膜溃疡形成。该法造模的最大缺点是动物全身毒性反应较重,而且室内温度要求控制在20℃ ~ 22℃ ,不同动物给药剂量也不相同可观察动物溃疡的面积及平均愈合时间,也可测定外周血或组织中超氧化物歧化酶( superoxide dismutase , sOD)和过氧化脂(Lipid PerOxide , LPO)的含量,从而探讨氧自由基在口腔溃疡中的作用机制。

  2.6放射法:选用SD大鼠,予以10%水合氯醛(3mL/kg ,腹腔注射)麻醉,麻醉起效后再用X射线照射左侧颊黏膜,右侧颊黏膜作为自身对照。用铅皮防护头部、右侧颊黏膜及大鼠身体其他部分。照射条件选用电压为210kV ,电流为12mA,源皮距为40cm,照射野为10cm x 15em,0. 25mm铜滤过,吸收剂量率为100.75cGy/ min,10Gy/次,1/d,周一至周五于每日15时开始照射,周末不照,周一到周三再照射3次,共照射8次,总吸收剂量为8OGy。观察发现,在SD大鼠总吸收剂量达到60Gy左右时,左侧颊黏膜已经开始出现不同程度的红斑;在达到80Gy左右时,开始呈现出一个或多个肉眼可见的明显溃疡病灶;80Gy 照射结束后4d左右,明显观察到有片状、大面积融合在一起的溃疡面出现;80Gy 照射结束后8d左右,溃疡病灶开始出现缓慢减轻的趋势;照射结束2周左右,左颊溃疡病灶基本愈合。右侧烦黏膜作为自身对照,在整个照射过程及照射后,未发现其有明显变化*。也有选用8个周大的C3H雌鼠,每次照射8Gy ,一共照5次便可形成典型的口腔溃3。该模型在选择合适的吸收剂量,通过分次照射,并对大鼠进行有效防护的情况下,能较好地模拟放射性口腔溃疡的发病过程,成功地建立放疗导致溃疡的动物模型,可作为放疗后溃疡研究的筛选模型。它为放射损伤治疗的研究提供动物学平台,为研究口腔溃疡的发病机制及防治奠定了坚实基础。但溃疡大小、多少、形成部位不确定,还有待进一步研究。2.7化疗法:方法一:选用小白鼠,腹部皮肤消毒,按20mg/ kg 的剂量,一次性腹腔注射氨甲喋呤。一般于第2d出现水肿,粘膜上皮脱落,表面出现分泌物等,形成溃疡[10]。方法二:雄性金黄地鼠,予以2次/d腹腔注射60mg/kg 5-Fu。注射后,以乙醚麻醉小鼠,麻醉起效后再用小钢丝刷将其左侧颊部粘膜造成磨损面。一般在化疗后第3d 出现溃疡。该方法建立的化疗后口腔溃疡动物模型与临床接近,其有一定的代表性,但溃疡形成的部位不确定。稳定动物模型的建立还需从口腔溃疡的动物选择、药物种类、给药剂量、发生时间、发生部位、以及药物应用途径等方面进行研究。

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