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原代细胞培养实验注意事项详解(原代细胞培养的实验过程)

发布时间:2022-04-01 10:27:16 阅读:110862次 来源:百度学术

原代细胞培养实验注意事项详解(原代细胞培养的实验过程)

  原代细胞的培养步骤

  一、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)培养要求

  1、细胞要通过充分漂洗,以尽量除去消化液的毒性;

  2、细胞接种时浓度要稍大一些,至少为5×108细胞/L;

  3、培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养;

  4、小牛血清浓度为10%-80%;

  5、应在37℃5% CO2的培养箱中培养;

  6、在起始的2天中尽量减少振荡,以防止刚贴壁的细胞发生脱落,漂浮;

  7、待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状,应将原代细胞换液;

  8、用骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时,应将细胞悬液经低速离心后换液。

  二、悬浮细胞的培养要求

  1、原代培养时要尽量去除红细胞;

  2、短期培养,可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行;

  3、细胞浓度可在5-8×109/L范围内进行分瓶试验;

  4、长期培养时,淋巴细胞中要加入生长因子,白血病细胞中要加入少量的原患者血清,以利细胞生长;

  5、细胞换液一般每隔3天需半量换液一次;

  6、细胞传代一般待细胞增殖加快、细胞密度较高时才能进行。

  三、原代细胞的维持

  1、贴壁细胞长成网状或基本单层时,未达到饱和密度,需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要;

  2、换入等量完全培养基或换成含2%小牛血清的维持液;

  3、悬浮细胞细胞培养基中不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖,此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求,需进行换液。通常采用半量换液的方法;

  四、原代细胞培养的*传代

  原代培养后由于悬浮细胞增殖,数量增加甚至达饱和密度;贴壁细胞的相互汇合,使整个瓶底逐渐被细胞覆盖,细胞难以继续生长繁殖,需要进行分瓶培养,这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。

  *传代应注意以下几点:

  (1)细胞生长密度不高时,不能急于传代。

  (2)原代培养的贴壁细胞需控制消化时间。

  (3)吹打已消化的细胞应减少机械损伤。

  (4)*传代时细胞接种数量要多一些。

  (5)*传代培养的pH应偏低些。小牛血清浓度可加大至15%~20%左右。

  五、其他培养法

  (一)组织块培养法

  组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。其基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶(或皿)中,瓶壁可预先涂以胶原薄层,以利于组织块粘着于瓶壁,使周边细胞能沿瓶壁向外生长。

  (二)悬浮细胞培养法

  对于悬浮生长的细胞,如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化,可采用低速离心分离,直接培养,或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。

  (三)器官培养

  器官培养是指从供体取得器官或组织块后,不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养,器官培养可保持器官组织的相对完整性,可用于重点观察细间的联-系、排列情况和相互影响,以及局部环境的生物调节作用。


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