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qPCR 实验准备和操作全过程的经验包

2022-12-12 10:22:14
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  一、前期保姆式准备,实验期间有备无患!

  1. 实验仪器:移液枪、qPCR 仪要定期校准(较准周期一般是 1 年),保证仪器准确性。

  2. 引物:引物设计后进行有效性验证,选取扩增效率在 90%~110% 之间,且融解曲线单峰的引物,保证其高效的扩增效率和特异性。

  3. 内参:如何选择、如何验证?

  选择:

  (1)通过已发表文章查找相同物种的内参,在实验体系上进行测试;

  (2)选择常见的内参,在实验体系上进行测试;

  (3)内部控制基因(Internal Control Genes,ICG)库中查找内参。

  验证:

  (1)尽可能选用多个内参同时进行实验;

  (2)通过在不同样本处理上的表达差异检测情况,来选择合适的内参,选择差异不显著的内参作为后续实验内参;

  4. 样品 cDNA :cDNA 模板需要稀释吗?应该稀释多少倍进行定量? 没有具体的稀释参考倍数,理论上 cDNA 每稀释 10 倍 CT 值变大

  3.可以根据这个规律进行合适的稀释。可以使用 cDNA 原液、10 倍稀释液、100 倍稀释液等梯度稀释模板进行定量实验,根据规律选择 CT 值落在 18~28 范围内的稀释倍数。

  二、提前排版 + 预混,准确加样不糊涂!

  1. 实验目的:比较未处理(对照组)和经处理后(处理组)的样本中某基因的表达变化。

  2. 实验分组与排板设计: 对照组和处理组除目的基因检测还需引入内参和 NTC(无模板阴性对照,用于排除实验体系中是否存在污染),每个处理做三个复孔。

  加样小 tips:

  ① 加样环境:qPCR 实验反应灵敏度高,所以配置预混液的过程应均在超净工作台中进行,防止污染;

  ② 配置条件:预混试剂在冰上操作,并避免强光直射,减少体系配置过程中导致模板降解、酶活降低以及荧光淬灭的可能;

  ③ 加样顺序:先加大体积,再加小体积液体;先加 NTC,再加模板。减小操作误差和污染风险;

  ④ 加样方式: ➣ 小体积加样可以采取移液器二档吸液一档出液(也就是说按到底吸液,出液的时候不要按到底),若不进行枪头更换,下个孔就是一档吸一档打,这样可以提高加样精确度和复孔的重复度;

  ➣ 如果离心管已有液体了,再加小体积的时候,把枪伸到液面下打,可以避免液体在枪头内残留; ➣ 吸液体的时候枪头不要没入液面下太深,并选低吸附枪头,减少枪头吸附引起的误差。

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