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细胞培养传代有什么注意事项(常见问题汇总)

发布时间:2022-08-17 10:42:05 阅读:12152次 来源:百度学术

细胞培养传代有什么注意事项(常见问题汇总)

  1.一般拿到细胞后,应注意什么

  收到细胞先不开盖,用酒精将整个细胞瓶外壁进行消毒,放在培养箱静置若干小时后(看细胞密度而定)在倒置显微镜下观察细胞生长情况,并对细胞进行不同倍数拍照(建议收细胞时的培养基拍一张照片,观察培养基的颜色和是否有漏液情况,显微镜下拍细胞100X,200X各两张),排除细胞本身污染的情况。

  2.何时须更换培养基

  视细胞生长密度而定,常规细胞2-3天更换培养基。

  3.细胞何时进行传代较好

  一情况下细胞生长至完全汇合后就应该传代,所有细胞生长都有一个要求不宜生长过密(也就是常说得长老了),但有接触抑制的细胞,在汇合前就必须进行传代,这类细胞一般在密度70-80%就进行传代,否则会引起细胞分化。

  4.贴壁细胞如何进行传代

  去掉原T25培养瓶里面的培养基,T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;弃PBS,再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化细胞,显微镜下观察,待细胞变圆,细胞间隙明显,部分细胞刚开始脱离瓶壁,加4 ml左右完全培养液混匀终止消化,将细胞小心吹打下来,1000 rpm/min室温离心5min;弃上清,细胞沉淀用完全培养液重悬,按要求分瓶(视细胞密度而定1:2-1:3,1:3-1:6,1:6-1:8),每T25瓶补足培养基至5-6 ml,37℃、5%CO2孵箱培养。

  5.悬浮性细胞应如何传代处理

  一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,将细胞悬液移入离心管中,1000 rpm/min 室温离心5 min。弃上清,细胞沉淀用完全培养液重悬,按要求分瓶(视细胞密度而定1:4-1:8),每T25瓶加完全培养液至4-5 ml,37℃、5%CO2孵箱培养。有些悬浮细胞趋于成团生长,此时细胞生长状态良好,当补液时,需避免反复吹打。

  6.贴壁细胞传代如何使用胰酶

  一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液浓度过高时,易造成培养基中细胞碎片增多,黑渣子增多,常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化,对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化,细胞密度过高超过80%时,采用分步消化法。胰酶储存在–20°C,解冻在4°C进行,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20°C,避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低,并可减少污染之机会。

  7.如何控制胰酶消化时间

  胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤:消化过度细胞碎片增多,黑渣子增多,细胞会成片脱落,严重影响细胞活性,并有部分细胞漂浮,随弃去的胰酶流失;消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下,反复吹打同样也会损伤细胞活性。

  不同细胞对消化液的敏感性不同,胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度,是否含EDTA,胰酶的储存时间,胰酶的储存温度,是否反复冻融,消化加入的胰酶体积,消化温度及细胞的密度有关。消化对于新购买的细胞,建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间,可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆,记录最佳消化时间,下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。

  8.细胞离心下来的离心速率应为多少

  细胞传代或冻存时欲回收细胞,其离心速度一般为800-1000 rpm/min,室温离心5-8分钟,转速过高,将造成细胞破裂死亡

  9.如何区分活细胞和死细胞

  显微镜下观察:活细胞中间透亮,饱满,有光泽,死细胞较暗。也可以通过台灯染色来计算细胞活力。

  10.如何用台盘兰计数活细胞

  无血清培养基把细胞悬液稀释到200~2000 个/毫升,在0.1 毫升的细胞悬液中加入0.1 毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼蓝,因而染成蓝色的细胞是死细胞,注意计数需在加入台盼蓝10min内完成。有细胞计数仪的,可直接用计数仪进行。

  11.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?

  钾离子的确抑制胰蛋白酶活性。

  12.使用胰蛋白酶加入EDTA是为什么

  EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子

  13.可否使用与原先不同的培养基

  不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基,若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基,细胞大都无法立即适应,易造成细胞状态不好,最终造成细胞无法存活。

  14.可否使用与原先不同的血清种类

  不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活


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