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细胞培养注意事项(入门级教程)

发布时间:2022-05-18 10:39:25 阅读:17122次 来源:百度学术

  一: 细胞房和生物安全柜(或超净工作台)先开紫外照射30min。作用:对环境灭菌(空气)。(备注:如果着急,至少也要开15分钟)

  在做实验之前考虑好需要哪些物品。开始照射之前,将所需要用到的物品都放到生物安全柜(或超净工作台)里面。常用移液枪或电动移液器等,需要在工作台上放置一套专用设备。

  细胞培养箱一般都已经调整好。定期留意一下二氧化碳是否足够。不够及时更换。

  二:显微镜需要定期消毒酒精擦拭。注意:显微镜一般都放在细胞房。

  三:进入实验之前,首先给自己带上拖鞋、头套,口罩,实验服,手套(手套带双层)。注意:手套要将袖口套进去。实验服、拖鞋最好是细胞房专用。

  四:开始操作之前先观察细胞

  首先观察细胞培养液的颜色。现在的细胞培养液通常都放有酸碱指示剂(绝大部分是酚红)。细胞在培养生长过程中,不断在培养液上清中累积酸性物质,时间长了,培养液变为黄色(同时培养液中营养物质耗尽)。

  其次镜下观察细胞的生长状态是否良好,是否需要传代。如果生长状态不好,需要对培养液进行调整(一般是加大血清浓度)。过于密集出现大片融合或太密集而导致细胞脱落,则进行传代。

  如果长势良好,且细胞培养液颜色未发生变化,可以酌情进行1/2、 1/3、1/4换液,也可以全换液。总之,视细胞生长情况而定。

  五:细胞培养预准备

  首先是准备各种溶液。

  1:配制溶液过程中要用到的水

  水用纯水,高压灭菌之后,再去内毒素。去内毒素方法很多,最简单可以放在烘箱180度3小时。或者过去内毒素的柱子后,高压灭菌。

  2:各种溶液灭菌

  抗生素用去内毒素水配制后,直接过滤除菌(过0.22u滤头)。可以用一次性无菌注射器过一次性0.22u滤头。

  现在用的培养液,如果是商业化液体培养基,不用处理。如果是粉末,需要用去内毒素水在生物安全柜(或超净工作台)进行配制,再过滤除菌。可以先配浓缩液(如10×),过滤除菌后。再用灭菌去内毒素水稀释成1×培养液。

  3:完全培养液的配制

  培养液加上合适比例的血清即可。但血清一般保存于-20℃,一般解冻是放在4℃冰箱解冻,耗时长,而且必须解决完全之后,才能进行完全培养基的配制。所以要提前几个小时就将血清从-20℃转入4℃,以期完全解冻。当然如果这一次就需要用完的话(是指用这些血清配制的培养液都用完),也可以放到37℃解冻。

  4:最重要的是保证过程中无菌

  液体必须要分装。无论过程中用到的培养液、胰酶、血清、PBS、生理盐水、抗生素尽量分装。分装是为了防止污染。如果操作有误,仅能威胁到其中一支,而非整个。

  培养液、血清、PBS、生理盐水分装为20mL、50mL或100mL/管,胰酶、抗生素可分装为1mL/管。

  注意:分装最好先于细胞操作

  5:操作之前,培养液先放到37度的细胞培养箱里复温。原因:尽量减少对细胞的刺激。低温对于细胞也是一个刺激因素。

  6:操作之前,大脑先过一遍此次操作所需要用到的所有用具。将所有用具先放到无菌台面上。减少拿入拿出的动作,保证无菌。(如果万一发现少拿了什么,也不要紧,再加上就是。如果是枪头盒、移液管等用具,最好先用消毒酒精喷一下)。

  7:操作之前,带着的手套先喷消毒酒精。然后再进入工作台。等一分钟,等手套上的酒精挥发之后再进行操作。

  六: 细胞培养操作过程

  注意无菌。无论哪一管液体,开盖后尽量立即关上(如果有几瓶都需要开的,也注意,可以虚盖)。盖子向上放。操作时不要从开盖的容器上方经过。另外,无菌台面上摆放的各种东西,最好是一字摆开,平行于自己。尽量不要前后重叠。

  细胞操作中所用的所有耗材试剂最好都是细胞培养专用。一般都以一次性耗材居多。1ML枪头为加长型专用培养枪头。移液管亦有专用10mL一次性无菌移液管

  1:细胞换液

  培养皿/瓶用枪头或移液管吸去原培养液,加入新培养液。

  2:细胞传代

  传代之前先观察,细胞是否密集,是否开始融合。一般融合达到70-80%就可以传代。早点传代也可以。

  如果是贴壁生长的细胞:

  1) 培养皿/瓶用枪头或移液管吸去原培养液;

  2) 无菌PBS或无菌生理盐水洗涤3次(按培养体积加入);

  3) 加入适量胰酶消化适当时间(一般胰酶为0.25%;9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶,一次加入1mL胰酶。消化时间视细胞类型等多种情况综合考虑,一般如果是细胞株,非原代培养,消化1-2分钟足矣);

  4) 用枪头吹打数十次(视细胞类型而定。一般细胞株30-50次吧,耗时一般2分钟左右);

  5) 加入适量体积完全培养基终止胰酶消化(如果是9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶,可以加入1mL完全培养基;现在培养瓶(皿)里有2mL溶液)。

  6) 现在可以将溶液进行分瓶(2mL)。如果是细胞株,直接均分到两个培养瓶(皿)里。如果是原代培养,可以根据消化时间来对细胞进行分离;因此可以将溶液(2mL)都转入新的培养瓶(皿)。

  7) 将两个培养瓶(皿)补足完全培养基到正常体积(果是9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶,为5mL完全培养液)

  8) 镜下观察。刚刚传代细胞还没贴壁,悬浮在溶液中,呈圆形。一般2h之内会贴壁,如果已经贴壁,根据细胞类型有不同的形态,但通常都不是圆形。

  9) 镜下观察无误之后,再放入细胞培养箱。培养瓶(皿)放入之前,可以用消毒酒精先擦一下。

  10) 传代之后,最好第二天细胞换液一次。当然,也可以视情况而定。

  七:收拾工作台。物品归位,倒出垃圾。再开紫外照射30min

  八:其它注意事项

  1:经常观察。最好是每天都显微镜下看一看,确定细胞状态。然后该换液换,该传代传,不用理会的就原样放回去。如果好几天都不想理会,可以放不完全培养基,或者低血清浓度的培养液,维持细胞生存,但不增殖。

  2:是否加抗生素。这个视情况而定。细胞培养过程中,是要求尽量少添加不相关的杂质。抗生素对于细胞来说,也是一种负担。但如果环境比较污染,直接添加好了。好比没病不用吃药,感冒了还是要吃药;婴儿没病但还是要打疫苗。

  3:胎牛血清的解冻。血清一般保存于-20℃,要放在4℃冰箱解冻,耗时长,500mL要好几个小时,我们经常是头天离开实验室之前放到4℃冰箱,过夜。所以经常分装成10mL或者20mL。这样,上午放到4℃冰箱,下午就可以用了。

  4:是否一定要细胞房以及是否要完全严格的遵守种种器具专用。这个吧,见仁见智。凡所有种种措施及设备都是为了保证培养操作过程中无菌,减少感染的机率;专用试剂耗材保证无菌无内毒素。细胞房也是这么一个措施而已,其它试剂耗材也是。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/1160.html

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