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Native PAGE 的步骤详解和注意事项

发布时间:2022-04-10 10:28:44 阅读:11912次 来源:科研日精进

  Native PAGE可用于从生物膜和总细胞和组织匀浆中一步分离蛋白质复合物。它还可用于确定天然蛋白质质量和寡聚状态,并确定生理蛋白质-蛋白质相互作用。天然复合物通过电洗脱或扩散从凝胶中回收,用于二维结晶和电子显微镜检查,或通过凝胶内活性测定或天然电印迹和免疫检测进行分析。

  原理

  Native PAGE使用与SDS-PAGE相同的不连续氯离子和甘氨酸离子前沿来形成移动边界,这些边界堆叠然后通过荷质比分离多肽。蛋白质在非还原非变性样品缓冲液中制备,该缓冲液保持蛋白质的二级结构和天然电荷密度。因此,如果目标蛋白在您的样品中具有聚合形式,可以轻松地从native PAGE凝胶的camshot中看到多个条带。在非变性PAGE电泳中,大多数蛋白质具有酸性或微碱性pl(等电点)(~3-8)并向负极迁移。例如,如果蛋白质pl大于8,9,可能应该反转阳极并运行native PAGE凝胶。

  相关试剂配制

  Buffers:

  For a 5ml native PAGE stacking gel

图例.png

  *: 在每次使用前添加。

  For a 10ml native PAGE separating gel:

1649406663931179.png

  *: 在每次使用前添加。

  Sample buffer (2x):

1649406690116106.png

  Running Buffer:

1649406719628495.png

  注意:运行缓冲液应为~ pH 8.3。不要调节 pH 值。

  凝胶电泳方案

  1.  在小烧杯中准备适量的分离胶,然后加入特定体积的分离胶。AP 和 TEMED 并轻轻旋转烧杯以确保充分混合。将凝胶溶液移入凝胶浇注的玻璃板之间的间隙中(不要完全填充)。用水填充剩余空间(或者异丙醇)。20-30 分钟完全凝胶化。

  2.  在分离胶凝胶化的同时制备浓缩胶溶液。在烧杯中准备适量的浓缩胶,并与 10% AP 和 1% TEMED 混合。将第一步中的水倒出,将浓缩凝胶溶液移入间隙并插入梳子。20-30分钟让它凝胶化。

  3.  将样品与样品缓冲液混合。不要加热样品!

  4.  加载样品混合物并设置适当的电压以运行电泳。注意:最好将系统放在冰上,不要设置相对较高的电压,以防蛋白质降解。

  5.  像标准考马斯蓝方案一样染色或进行免疫印迹程序(蛋白质印迹)。

  注意事项

  1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中,蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关,还和蛋白质的分子量以及分子形状有关,其中蛋白质的等电点是最重要的影响因子,要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统;

  2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中,要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性,所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度;

  3.  蛋白质的分子量较大,则电泳时间可以适当延长,以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开,反之亦然;

  4.  变性样品的离子强度不能太高(I<0.1mM)。调整样品的PH在4.0左右,这对于能否做好非变性样品非常重要。上样BUFFER 中没有SDS之外,加入样品后不能加热。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/1032.html

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