细胞复苏流程

　　1、从液氮罐中取出冻存细胞，放入37℃水浴锅中融化，轻柔离心后收集细胞沉淀；

　　2、缓慢用移液枪吸去上清，加入适量浓度和体积的完，全培养基，重悬细胞沉淀，转移至细胞培养皿或细胞培养瓶；

　　3、根据细胞培养皿或者培养瓶的体积，补足完，全培养基，放入二氧化碳培养箱中培养观察。

　　操作中的注意事项

　　（一）、小心取出冻存管

　　许多小型液氮罐的设计是将细胞冻存在带盖的提篮中，提篮会浸没在液氮中。由于提篮中没有孔格的划分，细胞冻存管无法摆放整齐。取用细胞时候，实验人员经常需要逐一查看，寻找计划复苏的细胞。此过程耗时过久，可能会导致其他冻存管内的细胞受损。

　　一般大型液氮罐会配置成列的冻存架和细胞存储盒，取出冻存架和放回都需要平稳小心处理，避免带出大量液氮。罐内液氮较多时，可适当在罐口附近停留，等大部分液氮回流后再拎出。

　　注意

　　液氮在室温下会快速气化吸热，溅到皮肤或者眼睛上会烫伤。从液氮罐中取细胞时，需要做好防护工作——戴好厚手套和护目镜。

　　不要将冻存管丢入液氮罐，以防液氮溅出。

　　（二）、快速融化待复苏细胞

　　当找到准备复苏的冻存管后，不要着急放入水浴锅，先检查封口膜是否完整，如果贴了医用胶布，胶布是否有破损？因为一旦冻存管中有液氮流入，直接放入水浴锅中，管内压力骤升，可能导致冻存管炸裂，危及实验人员。

　　复苏细胞的核心技术，简而言之就是快融。从液氮罐中取出的细胞，需及时放入37℃水浴锅，进行快速融化，期间需不停地轻柔摇晃冻存管。，好在两分钟内完，全融化细胞。出于卫生考虑，有些细胞房没有水浴锅，所以很多复苏操作，需要在不同实验室进行。如果两个实验室距离较远，且实验室室温较高，可提准备一只干净的烧杯，装入37℃的水作中间缓冲。

　　注意

　　·融化中不要让水浴锅中的水，流入冻存管中造成污染。

　　·复苏过程中要格外注重无菌操作，经水浴锅融化后，需对冻存管消毒。，好同时更换手套和口罩，全程避免移液器接触管口及管壁。可以将冻存管放入无菌一次性PE手套中，再放入水中融化，避免污染也方便操作。

　　（三）、轻柔收集已复苏细胞

　　收集细胞，要将所用培养基提配制预热并摆放整齐，避免现用现配耽误复苏进程，让刚复苏的细胞及时接触正常的生长环境。若冻存液中存在DMSO，请根据所用细胞对其敏感的程度，判断要不要离心弃除。

　　刚复苏的细胞状态比较脆弱，应避免多次吹打和离心。比如原代细胞在复苏融化后，尽量不要进行离心操作，直接补足培养基，使细胞分散均匀，等3-6小时，细胞贴壁后，进行换液处理。此方式也适用于其他冻存状态一般的细胞。

　　（四）、培养，计数&活力检测

　　复苏过程中，细胞计数必不可少。原则上，冻存和复苏后，都需要对细胞进行计数和活率分析，判别冻存的效果和细胞复苏后的状态。

　　2018年9月，美国药典（USP-NF）出台了关于细胞冻存相关政策并明确指出，台盼蓝不能很好地识别刚复苏的细胞（细胞的种类和台盼蓝的浓度不同，对染色结果都有较大的影响），建议使用两种以上的方法进行细胞计数，如结合荧光染色计数法。