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细胞培养瓶中的细胞为什么无法贴壁?贴壁细胞传代培养步骤

发布时间:2022-09-18 10:35:09 阅读:13742次 来源:百度学术

  贴壁细胞是目前细胞培养中的主要类型,它们需要吸附在支持物表面,依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、繁殖。有时候我们会发现细胞培养瓶中的细胞无法贴壁,这是什么原因引起的呢?

  细胞贴壁是适应环境的一种反应,密度大于培养基的细胞会沉降在底面上,如果细胞要生存必定得改善这个环境,分泌细胞外基质,改善底面结构,然后很自然就贴附在底面上了。密度小于水的细胞会漂浮在液面上,所以不可能贴在底面上,但是如果将培养液加满,使细胞能够与细胞培养方瓶上面的壁接触同样可以贴壁。如果细胞出现不贴壁的情况,可以从以下几个方面分析:

  1、细胞的传代最重要的是胰酶处理时间:消化不够细胞本身就是成团的;若胰酶处理太久,容易造成细胞膜蛋白损伤,使细胞贴壁不紧,显微镜下观察立体感不强,严重的时候甚至会造成细胞死亡。

  2、缺少贴壁因子:血清中含有促贴壁因子,而无血清培养基工艺中由于缺少这种促贴壁因子,细胞的贴壁效果会下降很多。

  3、支原体或细菌的污染。

  4、培养液配置、储存不当,如pH值过碱,Gln量太少等原因。

  5、复苏的细胞本身状态不好,已经老化,失去贴附性。

  6、接种细胞数目太少,无法分泌足够的细胞外基质。

  7、复苏时处理速度太慢,复苏过程不当。

  综合来看,贴壁细胞出现不贴壁现象主要是以上几个方面的原因。此外,塑料材质的细胞培养瓶如果未经过表面TC处理,也会影响细胞的贴壁性能。

贴壁细胞传代培养步骤

  1. 弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

  2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

  3. 轻轻吹打后吸出,移入15ml离心管中,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养液后吹匀。

  4 . 收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1:2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中,建议冻存一支备用,后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

  5.贴壁细胞的生长必须仔细监测以确保细胞保持健康。根据细胞类型,很多贴壁细胞在其达到70-90%密度,也就是覆盖了培养容器表面的70-90%时需要传代。

  这些细胞系虽然保留了原细胞源的很多特征,但是每次传代也会使它们开始产生一些扩增细胞的特有特性。因此,对任何一个特定细胞系,要考虑限制传代的次数。

  6.很多贴壁细胞系可天然附着于无涂层的塑料上。因此,塑料细胞培养板如培养皿或六孔板经常用于传代细胞。塑料的细胞培养瓶也经常用到,如T25的细胞培养瓶,常用于扩增培养数目少的细胞或者开始培养生长缓慢的细胞系。T75细胞培养瓶常用在培养扩增速度较快的细胞系或用于生长超过T25培养瓶容量的大量细胞。

  7.在转移贴壁细胞时,要先剪切掉细胞上与和塑料结合的蛋白。因此,消化酶胰酶常用于消化细胞。控制胰酶消化的时间很重要,因为如果处理时间过长会损坏细胞表面的蛋白。

  8.细胞培养液能中和胰酶。所以在胰酶消化前常用磷酸缓冲液或PBS洗涤细胞。EDTA,一种钙螯合剂有时候也用于提高胰酶的蛋白水解功能。

  9.为扩增细胞克隆,将新鲜传代的细胞培养于细胞培养箱中,选择适合该细胞生长条件,通常为温度37度,二氧化碳5%和湿度95%。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1597.html

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