贴壁细胞是目前细胞培养中的主要类型，它们需要吸附在支持物表面，依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、繁殖。有时候我们会发现细胞培养瓶中的细胞无法贴壁，这是什么原因引起的呢？

　　细胞贴壁是适应环境的一种反应，密度大于培养基的细胞会沉降在底面上，如果细胞要生存必定得改善这个环境，分泌细胞外基质，改善底面结构，然后很自然就贴附在底面上了。密度小于水的细胞会漂浮在液面上，所以不可能贴在底面上，但是如果将培养液加满，使细胞能够与细胞培养方瓶上面的壁接触同样可以贴壁。如果细胞出现不贴壁的情况，可以从以下几个方面分析：

　　1、细胞的传代最重要的是胰酶处理时间：消化不够细胞本身就是成团的；若胰酶处理太久，容易造成细胞膜蛋白损伤，使细胞贴壁不紧，显微镜下观察立体感不强，严重的时候甚至会造成细胞死亡。

　　2、缺少贴壁因子：血清中含有促贴壁因子，而无血清培养基工艺中由于缺少这种促贴壁因子，细胞的贴壁效果会下降很多。

　　3、支原体或细菌的污染。

　　4、培养液配置、储存不当，如pH值过碱，Gln量太少等原因。

　　5、复苏的细胞本身状态不好，已经老化，失去贴附性。

　　6、接种细胞数目太少，无法分泌足够的细胞外基质。

　　7、复苏时处理速度太慢，复苏过程不当。

　　综合来看，贴壁细胞出现不贴壁现象主要是以上几个方面的原因。此外，塑料材质的细胞培养瓶如果未经过表面TC处理，也会影响细胞的贴壁性能。

贴壁细胞传代培养步骤

　　1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

　　2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

　　3. 轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

　　4 . 收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

　　5.贴壁细胞的生长必须仔细监测以确保细胞保持健康。根据细胞类型，很多贴壁细胞在其达到70-90%密度，也就是覆盖了培养容器表面的70-90%时需要传代。

　　这些细胞系虽然保留了原细胞源的很多特征，但是每次传代也会使它们开始产生一些扩增细胞的特有特性。因此，对任何一个特定细胞系，要考虑限制传代的次数。

　　6.很多贴壁细胞系可天然附着于无涂层的塑料上。因此，塑料细胞培养板如培养皿或六孔板经常用于传代细胞。塑料的细胞培养瓶也经常用到，如T25的细胞培养瓶，常用于扩增培养数目少的细胞或者开始培养生长缓慢的细胞系。T75细胞培养瓶常用在培养扩增速度较快的细胞系或用于生长超过T25培养瓶容量的大量细胞。

　　7.在转移贴壁细胞时，要先剪切掉细胞上与和塑料结合的蛋白。因此，消化酶胰酶常用于消化细胞。控制胰酶消化的时间很重要，因为如果处理时间过长会损坏细胞表面的蛋白。

　　8.细胞培养液能中和胰酶。所以在胰酶消化前常用磷酸缓冲液或PBS洗涤细胞。EDTA，一种钙螯合剂有时候也用于提高胰酶的蛋白水解功能。

　　9.为扩增细胞克隆，将新鲜传代的细胞培养于细胞培养箱中，选择适合该细胞生长条件，通常为温度37度，二氧化碳5％和湿度95%。