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流式细胞术实验中为何使用活力检测染料?

发布时间:2022-07-09 10:39:37 阅读:14632次 来源:百度学术

  活力检测染料在细胞计数和传代、评估化学毒性以及进行流式细胞术实验时广泛使用,因为它们可以让人们将活细胞与死细胞或濒死细胞区分开来。它们经常用于流式细胞术以提高数据质量,其中在分析中包含死细胞可能会扭曲实验结果。

  健康活细胞的生物学与死亡或濒死细胞的生物学不同。此外,即使特定目标或目标通路的生物学没有被破坏,抗体在死细胞中也经常表现出高度的非特异性结合,从而阻碍了可靠的分析。从您的分析中排除死亡和垂死的细胞对于确保您的数据准确和可重复性至关重要。

  活力检测染料如何起作用?

  非固定细胞的活力染色:

  最常用的活力检测染料是与核酸相互作用的 DNA 嵌入染料。它们无法穿过完整的质膜,因此从活细胞逐出,活细胞不会被标记,而死细胞将明亮着染(图 1)。具有不同激发/发射曲线的染料的一些例子包括碘化丙啶 (PI)、7-氨基放线菌素 D (7-AAD) 和 DRAQ7™。虽然这些染料可用于活细胞实验,但如果实验需要固定和/或透化细胞,这些染料会从死细胞中扩散出来并冲走,从而限制它们的效用。

图例

  图 1. PI 染色概况。使用 PI/RNAse Staining Solution #4087 染色的健康 Jurkat 细胞(左图)和 Jurkat 活细胞与非活细胞的混合群(右图)示例。

  虽然 DNA 嵌入染料能够对活细胞进行负向选择,但也有多种染料可用于活细胞的正向选择。尽管它们使用不同的机制来专门标记活细胞,但它们通常依赖于标准的代谢过程来做到这一点。一种常用于活细胞阳性选择的染料钙黄绿素 AM 是一种非荧光中间体,可以穿过完整的细胞膜。当细胞内酯酶作用时,钙黄绿素 AM 在活细胞中形成荧光产物钙黄绿素。与钙黄绿素 AM 不同,钙黄绿素不是膜渗透性的,因此它不能通过跨质膜扩散而逃逸。由于钙黄绿素保留在活细胞内,这些细胞会发出荧光。

  固定细胞的活力染色

  最后,胺活性染料是另一类活力检测染料。与 DNA 嵌入染料一样,它们明亮地标记死细胞,但与 DNA 嵌入染料不同,它们共价结合目标,使用户能够在不丢失信号的情况下固定和/或透化细胞。尽管从技术上讲,所有细胞在固定和透化后都已死亡,但事先使用胺活性染料(例如 CST 的 Ghost Dye™)可以让研究人员在固定整个群体时将活着的细胞与死亡的细胞分离。胺活性染料也将标记活细胞,因为任何给定细胞的胺反应性基团的一小部分在细胞外可用于标记。与同一样品中的健康细胞相比,丧失膜完整性的无活力细胞将与显著更多的染料发生反应。可以从分析中排除这些将被最亮标记的无活力细胞。

图例

  图 2. Ghost DyeTM Violet 450 染色特征。活化和固定的人外周血单核细胞结合且染有 Ghost Dye™ Violet 450 Viability Dye #49826 。

  如何在流式细胞术实验中使用活力检测染料

  当使用 DNA 嵌入染料或胺活性染料时,无法存活的细胞将在染料的发射通道中显示明亮的信号;一定要从您的分析中排除这个群体。如果使用阳性选择染料,活细胞将显示阳性染色,因此应将阴性细胞排除在下游分析之外。

  最终想法

  活力检测染料提供了一种提高数据可信度的简单方法——大多数只需要很短的潜伏期即可分离活细胞和死细胞。与往常一样,在将活力检测染料加入实验时,最佳做法是参考制造商推荐的实验步骤。

  Browse Ghost Dyes.

  选择参考文献:

  Darzynkiewicz, Z. et al. (1992) Cytometry 13(8), 795-808.

  O’Brien, M. and Boston, W. (1995) Cytometry 19(3), 243-255.

  Edward, R. (2012) Methods Enzymol. 505, 23-45.

  Cumba Garcia, L. et al. (2016) J. Immunol. Methods 439, 23-28.

  Sullivan, G. et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36(1), 39-45.

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