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细胞集落形成实验(慢病毒的菌落形成滴度测定)

发布时间:2022-03-01 10:42:47 阅读:16642次 来源:百度学术

  该协议可用于滴定赋予抗生素耐药性的慢病毒制剂。确定慢病毒制剂的滴度可让您控制下游研究中的感染复数 (MOI)。该协议是为 A549 细胞开发的,但可以适应各种靶细胞系和选择标记。请注意,该测定需要用结晶紫溶液染色抗性菌落,因此,细胞不能用于以后的实验。

  工作流程时间表

  设备

  第 0 天:种子和转导细胞

  第 2 天:用含有选择试剂的新鲜培养基更换培养基。

  第 3-14 天:根据需要更换介质

  第 14-18 天:染色细胞和计数抗性菌落

  试剂

  生物安全柜

  移液器

  移液器

  孵化器

  DMEM高糖

  L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(或替代稳定谷氨酰胺)

  热灭活胎牛血清

  聚凝胺

  PBS pH 7.4,不含钙或镁(阳离子会影响贴壁细胞的附着)

  微量离心管

实验数据

  6孔盘

  移液器

  移液器吸头

  0.1% 结晶紫

  0.22 μm 聚醚砜滤膜(用于结晶紫溶液)

  0.45 μm 聚醚砜过滤器(用于病毒制备,如果制备之前未过滤)

  过滤用注射器

  慢病毒制备

  试剂制备

  DMEM Complete:10% v/v FBS 和 4 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺

  在 500 mL 的 DMEM 高葡萄糖瓶中,加入 55 mL 的热灭活 FBS 和 11 mL 的 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。4℃保存。

  *Pro-Tip*不同品牌和批次的 FBS 可以促进或抑制转染。测试各种品牌和大量 FBS,以找到适合您的协议的一种。FBS可以购买已经头部灭活的,也可以在实验室加热至56℃30分钟灭活。

  开始之前的注意事项

  目标细胞系的健康状况对于获得准确的滴度至关重要。

  定期检查细胞是否有支原体

  不要过度或过度生长您的细胞。

  传代 20-30 次后解冻一瓶新的细胞。

  不要在培养基中添加青霉素/链霉素。

  细胞系之间的滴度会有所不同。

  不建议对慢病毒上清液进行多次冻融循环。

  该协议概述了在病毒转导的同时播种细胞。对于某些细胞系,如果在病毒转导前一天接种细胞,则可以优化转导。请注意,在这种情况下,聚凝胺只能在病毒转导时添加,而不是在细胞播种步骤期间添加。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/882.html

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