该协议可用于滴定赋予抗生素耐药性的慢病毒制剂。确定慢病毒制剂的滴度可让您控制下游研究中的感染复数 (MOI)。该协议是为 A549 细胞开发的，但可以适应各种靶细胞系和选择标记。请注意，该测定需要用结晶紫溶液染色抗性菌落，因此，细胞不能用于以后的实验。

　　工作流程时间表

　　设备

　　第 0 天：种子和转导细胞

　　第 2 天：用含有选择试剂的新鲜培养基更换培养基。

　　第 3-14 天：根据需要更换介质

　　第 14-18 天：染色细胞和计数抗性菌落

　　试剂

　　生物安全柜

　　移液器

　　移液器

　　孵化器

　　DMEM高糖

　　L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（或替代稳定谷氨酰胺）

　　热灭活胎牛血清

　　聚凝胺

　　PBS pH 7.4，不含钙或镁（阳离子会影响贴壁细胞的附着）

　　微量离心管

　　6孔盘

　　移液器

　　移液器吸头

　　0.1% 结晶紫

　　0.22 μm 聚醚砜滤膜（用于结晶紫溶液）

　　0.45 μm 聚醚砜过滤器（用于病毒制备，如果制备之前未过滤）

　　过滤用注射器

　　慢病毒制备

　　试剂制备

　　DMEM Complete：10% v/v FBS 和 4 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺

　　在 500 mL 的 DMEM 高葡萄糖瓶中，加入 55 mL 的热灭活 FBS 和 11 mL 的 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。4℃保存。

　　*Pro-Tip*不同品牌和批次的 FBS 可以促进或抑制转染。测试各种品牌和大量 FBS，以找到适合您的协议的一种。FBS可以购买已经头部灭活的，也可以在实验室加热至56℃30分钟灭活。

　　开始之前的注意事项

　　目标细胞系的健康状况对于获得准确的滴度至关重要。

　　定期检查细胞是否有支原体

　　不要过度或过度生长您的细胞。

　　传代 20-30 次后解冻一瓶新的细胞。

　　不要在培养基中添加青霉素/链霉素。

　　细胞系之间的滴度会有所不同。

　　不建议对慢病毒上清液进行多次冻融循环。

　　该协议概述了在病毒转导的同时播种细胞。对于某些细胞系，如果在病毒转导前一天接种细胞，则可以优化转导。请注意，在这种情况下，聚凝胺只能在病毒转导时添加，而不是在细胞播种步骤期间添加。