该协议可用于滴定赋予抗生素耐药性的慢病毒制剂。确定慢病毒制剂的滴度可让您控制下游研究中的感染复数 (MOI)。该协议是为 A549 细胞开发的，但可以适应各种靶细胞系和选择标记。请注意，该测定需要用结晶紫溶液染色抗性菌落，因此，细胞不能用于以后的实验。
工作流程时间表
设备
第 0 天：种子和转导细胞
第 2 天：用含有选择试剂的新鲜培养基更换培养基。
第 3-14 天：根据需要更换介质
第 14-18 天：染色细胞和计数抗性菌落
试剂
生物安全柜
移液器
移液器
孵化器
DMEM高糖
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（或替代稳定谷氨酰胺）
热灭活胎牛血清
聚凝胺
PBS pH 7.4，不含钙或镁（阳离子会影响贴壁细胞的附着）
微量离心管
6孔盘
移液器
移液器吸头
0.1% 结晶紫
0.22 μm 聚醚砜滤膜（用于结晶紫溶液）
0.45 μm 聚醚砜过滤器（用于病毒制备，如果制备之前未过滤）
过滤用注射器
慢病毒制备
试剂制备
DMEM Complete：10% v/v FBS 和 4 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
在 500 mL 的 DMEM 高葡萄糖瓶中，加入 55 mL 的热灭活 FBS 和 11 mL 的 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。4℃保存。
*Pro-Tip*不同品牌和批次的 FBS 可以促进或抑制转染。测试各种品牌和大量 FBS，以找到适合您的协议的一种。FBS可以购买已经头部灭活的，也可以在实验室加热至56℃30分钟灭活。
开始之前的注意事项
目标细胞系的健康状况对于获得准确的滴度至关重要。
定期检查细胞是否有支原体
不要过度或过度生长您的细胞。
传代 20-30 次后解冻一瓶新的细胞。
不要在培养基中添加青霉素/链霉素。
细胞系之间的滴度会有所不同。
不建议对慢病毒上清液进行多次冻融循环。
该协议概述了在病毒转导的同时播种细胞。对于某些细胞系，如果在病毒转导前一天接种细胞，则可以优化转导。请注意，在这种情况下，聚凝胺只能在病毒转导时添加，而不是在细胞播种步骤期间添加。
