细胞外基质( extracellular matrix , ECM )是由大分子构成的错综复杂的网络。为细胞的生存及活动提供适宜的场所,并通过信号转导系统影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化。
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)可以降解细胞外基质成份,需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子,是一组具有许多共同生化性质的可降解细胞外基质的酶。基质金属蛋白酶2(MMP2)主要降解IV型胶原,基质金属蛋白酶9(MMP9)可以降解弹性蛋白、胶原蛋白、明胶和纤维蛋白等细胞外基质的成分。基质金属蛋白酶的失调是多种疾病发生、发展的重要机制之一。
明胶酶谱实验可以检测MMP2和MMP9的活性,是分子生物学的常用实验技术之一。先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明胶)电泳分离,然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性,在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶,最后用考马斯亮蓝将凝胶染色,再脱色,在蓝色背景下可出现白色条带,条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
实验流程如下:
一.样品制备
组织或细胞的蛋白样品制备可用常规的方法,但需注意蛋白裂解液中不能加入EDTA,因为EDTA是金属离子螯合剂,可以络合Zn2+,抑制MMP的活性;也不能加入β-巯基乙醇或DTT,因为会导致蛋白的二硫键被打开,蛋白不能复性。推荐用PBS或Tris缓冲液(pH7.5)作为蛋白提取的缓冲液,可以加入0.5%的PMSF。
二.SDS-PAGE
1)SDS-PAGE 凝胶配制
细胞外基质( extracellular matrix , ECM )是由大分子构成的错综复杂的网络。为细胞的生存及活动提供适宜的场所,并通过信号转导系统影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化。
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)可以降解细胞外基质成份,需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子,是一组具有许多共同生化性质的可降解细胞外基质的酶。基质金属蛋白酶2(MMP2)主要降解IV型胶原,基质金属蛋白酶9(MMP9)可以降解弹性蛋白、胶原蛋白、明胶和纤维蛋白等细胞外基质的成分。基质金属蛋白酶的失调是多种疾病发生、发展的重要机制之一。
明胶酶谱实验可以检测MMP2和MMP9的活性,是分子生物学的常用实验技术之一。先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明胶)电泳分离,然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性,在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶,最后用考马斯亮蓝将凝胶染色,再脱色,在蓝色背景下可出现白色条带,条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
实验流程如下:
一.样品制备
组织或细胞的蛋白样品制备可用常规的方法,但需注意蛋白裂解液中不能加入EDTA,因为EDTA是金属离子螯合剂,可以络合Zn2+,抑制MMP的活性;也不能加入β-巯基乙醇或DTT,因为会导致蛋白的二硫键被打开,蛋白不能复性。推荐用PBS或Tris缓冲液(pH7.5)作为蛋白提取的缓冲液,可以加入0.5%的PMSF。
二.SDS-PAGE
1)SDS-PAGE 凝胶配制
脱色时间可以根据观察到的脱色效果调整。
