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分子生物学实验-浅谈DNA聚合酶

发布时间:2021-12-24 10:09:27 阅读:112342次 来源:本站

  众所周知,DNA聚合酶是DNA复制中十分重要的一种酶,它催化dNTP的聚合,使dNTP以一条亲代DNA为模板形成一条完整的子代DNA,与亲代为互补序列。

  形状与结构

  如果使劲想象,DNA聚合酶的结构就像一只微微张开的右手。它有手指域 (finger region)和手掌域 (palm region),手掌域结合引物-模版接头和新合成的DNA。

Figure 1. DNA聚合酶的形状和结构

  Figure 1. DNA聚合酶的形状和结构

  或许有人会问,同一个蛋白的活性位点是怎么结合不同DNA的呢?DNA各种各样的序列为什么不会影响结合呢?这背后的原因是,DNA聚合酶会结合在DNA的小沟 (minor groove)而非大沟 (major groove)。不同的碱基配对在大沟中有许多种pattern的氢键供体/受体,而在小沟中,每个碱基对两侧都是受体 (如图)。所以,只要这条DNA遵循沃森-克里克碱基配对原则,DNA聚合酶就可以在小沟中结合,与序列无关。

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  Figure 2. 大沟和小沟的氢键供体/受体分布。A为Acceptor,即受体;D为Donor,即供体。H和M分别为氢原子和甲基。(图源:MIT分子生物学online course)

  在DNA复制过程中,模板在活性位点旁边向下弯曲45度,这保证了唯一一个在活性位点中的核苷酸 (即下一个将要被配对的核苷酸),一定是紧接着上一个配对完的核苷酸,而不是模板中的其他核苷酸。

Figure 3. 模板弯曲45度示意图

  Figure 3. 模板弯曲45度示意图。

  聚合酶的运作方式

  DNA聚合酶的手指域一开一合,参与催化dNTP添加至模板上。新加入的dNTP会与两个二价金属离子 (绝大部分时候是镁离子) 结合以稳固三磷酸盐的位置 (这就是为什么二价金属的螯合剂会让DNA聚合酶失活)。

  手指域中有一个叫O-helix的东西,它其中的三个氨基酸会分别与核苷酸、β磷酸和ɣ磷酸相互作用,O-helix就会被压到碱基对上面。

  这是手指域“关上”的状态。这样的好处是,水分子进不来,水解反应不会发生,所以在这里唯一能发生的反应就是前面提到过的羟基敲掉磷酸。

  当焦磷酸盐被释放,O-helix中的两个氨基酸不再与β磷酸和ɣ磷酸相互作用,所以亲和力变低,手指域“打开”。整条DNA链下移一个碱基对,新的dNTP添加又可以开始啦。

Figure 4. O-helix和其中三个氨基酸与dNTP的相互作用

  Figure 4. O-helix和其中三个氨基酸与dNTP的相互作用。(图源: MIT分子生物学online course)

  避免错误配对

  在沃森-克里克碱基配对原则中,DNA里的A总是会与T互补配对,G总是会与C互补配对。

  之所以这样配,是因为一个嘌呤+一个嘧啶的距离(宽度?)几乎完全相等,而这个相等的距离在DNA聚合酶催化反应中起到重要的作用。

  下一个dNTP的ɑ磷酸必须要在最靠近上一个核苷酸3’OH的位置才能被它SN2亲核攻击,让β和ɣ磷酸被敲掉(脱落形成焦磷酸盐),反应才得以继续。

  如果出现任何一种错配的情况(碱基对之间距离变大/变小),ɑ磷酸都不会在正确的位置上,羟基也不能进攻。就算错配可以发生,错配核苷酸之间的亲和力较弱,不允许游离的dNTP在聚合酶活性位点中逗留。所以,错误的dNTP很快就会跑掉了。

Figure 5. 正确配对。正确的距离让羟基能立刻攻击ɑ磷酸

  Figure 5. 正确配对。正确的距离让羟基能立刻攻击ɑ磷酸。

  聚合酶的“犯错"

  整个DNA复制平均10000000000(1E10)个bp(base pair,碱基对)中会有一个错误,但是DNA聚合酶平均100000(1E5)个bp中就会有一个错误。😡

  大多数错误都是嘧啶替代了另一种嘧啶,或嘌呤替代了另一种嘌呤。这种错误是因为一种叫互变异构 (tautomerism)的东西。四个碱基可以在amino/imino形式,或keto/enol形式之间转变,它们互为互变异构体。

  以cytosine举例,它通常处于amino的状态,但也有可能转变为imino。当它这样转变时,它的氢键供体/受体的排列pattern会变。这下,碱基配对的特异性被改变——可以与它配对的碱基变了,C便可以与A配对。但是,当它们的氢键形成后,C又会立刻变回amino的状态。这下DNA聚合酶发现它加错核苷酸了,并且它无法再与DNA小沟进行结合——DNA聚合酶会立刻停止工作。这会减慢随后的DNA合成,并需要校读型核酸外切酶 (proofreading exonuclease)来纠正。


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