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细胞实验-细胞污染原因及培养过程注意事项

发布时间:2021-11-25 10:18:40 阅读:110782次 来源:百度学术

  对许多生物学研究人员而言,培养细胞的最重要之处在于培养细胞时必须注意细胞污染问题,一般说来,细胞污染不可避免,但可降低其发生的频度及后果的严重程度,因此在细胞培养时必须注意细胞培养的环境。

  细胞污染根据污染源主要可以分为化学性,物理性和生物性污染。

  化学性污染

  培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。化学物质并不总是抑制细胞的生长,某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。

  细胞培养的必需养分,如氨基酸,若浓度超过了合适的范围,也会对细胞产生毒性。同样,不同细胞系其最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的,在培养中应严格控制。

  玻璃制品清洗过程中残留的变性剂或肥皂(通常残留在瓶盖的内表面)是最常见的化学性污染。为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染,在配制液体,清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水。

  动物血清是细胞培养中常用的天然培养基,但血清又是潜在的生物及化学污染的来源。由于血清采集于多个动物,而且不同厂商的生产工艺及质量各不相同,因此血清中许多成分的浓度存在很大的变异。血清对不同细胞的促生长能力及毒副作用取决于这些细胞的分化功能、组织来源及培养基的成分等因素。在进行一系列实验时,为了保证实验的可重复性,最好选用同一批次的血清。

  细胞培养使用的所有物质都应是高纯度的,并经过权威机构的鉴定,实验者应对上述成分进行纯度鉴定。同时,正确配置和储存培养液及试剂也是非常重要的,应该采取标准的操作步骤,避免液体体积计算错误,混用类似化合物等错误。

   物理性污染

  物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分,从而影响细胞的代谢。培养环境中的物理因素,如温 度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。

  细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中,可以引起细胞代谢发生改变,如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。通过实验室的合理设计及建立规范的操作规程,可以减少环境中物理因素对细胞的影响。孵箱应放在温度较恒定的环境中,周围不能放置能引起机械振动的设备,如离心机。

  培养液及培养试剂应放在固定的位置,为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中,试剂周围不能放同位素。培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实验,以避免过冷的温度对细胞的影响。

  微生物污染

  由于体外培养的细胞自身没有抵抗污染的能力,而在培养基中加抗生素的抗污染能力也是有限的,因而细胞微生物污染一旦发生往往是无法挽救的。一般在细胞受到污染早期或污染较轻时,能及时处理并除去污染物,部分细胞还有可能得到挽救。

  不同的微生物污染物对细胞的影响也有差别,微生物中支原体和病毒对细胞形态和技能的影响是长期的,缓慢的和潜在的。而霉菌和细菌增殖迅速,能在很短的时间内抑制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞。

  霉菌污染

  种类很多,污染的多是曲霉菌,白色念珠菌,酵母菌,黑霉菌,孢子菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成淡黄色或是白色的漂浮物,一般肉眼可见,较易被发现,短期内培养液多不变混浊。

  倒置显微镜下可以看见细胞之间有纵横交错穿行的丝状,树枝状或管状菌丝,并漂浮在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形,散在细胞上及细胞周边生长。

  处理:确认是霉菌污染,如果细胞种类不是特别珍贵,直接放弃,并将实验环节彻底消毒。

细胞培养

  细菌污染

  细菌污染较常见的有大肠杆菌,白色葡萄球菌,假单孢菌等。加用抗菌素的培养液可预防和排除个别一般少量细菌的污染。一旦发生细菌污染很容易发现,多数情况下培养液短时间内变黄,表明有大量酸性物质产生,出现明显浑浊现象;有时静置的培养液起初不混,但稍加震荡,就有许多混浊物漂起。

  倒置显微镜下观察,可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮,有时在细胞表面及周围有大量细菌存在,细胞停止生长并有中毒表现。必要时可取少量培养液涂片染色检查以明确细菌种类;有的培养液改变不明显而有疑似污染,亦可向肉汤培养基内地入少量培养液,37℃培养以检测。

  处理:一般用抗生素的常用量的5~10倍作冲击疗法,用药24~48小时后再换常规培养液,有时在早期污染时此法有效。细胞培养中用抗生素多为预防细菌污染,一半多联合应用。一旦发生污染后再使用抗生素常常难以根除,有的抗生素只有抑菌作用而无杀菌效应。

  支原体污染

  支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2um)并独立生活的微生物.约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性.可为圆形、丝状或梨形。

  支原体形态多变,在光境下不易看清内部结构。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7.6-8.0),对酸耐受性差。对热比较敏感,对一般抗生素不敏感。

  支原体污染细胞后.培养液可不发生混浊.多数情况下细胞病理变化轻微或不显著,细微变化也可由于传代、换液而缓解.因此易被忽视。但个别严重者,可致细胞增殖缓慢.甚至从培养器皿脱落。

  为确定有无支原体污染可做如下检测:

  a:相差显微境检测;

  b:荧光染色法;

  c:电镜检查;

  d:DNA分子条文检查或支原体培养等方法。

  处理:市场上有多种支原体清除试剂盒,效果比较好。

  酵母污染

  酵母到处存在,并能在合适的环境中快速生长。酵母污染很容易观察到,培养物变浑浊,尤其在后期。一般PH值变化很小,严重时,PH值升高。显微镜下呈卵圆形或球形颗粒,有些会芽生较小颗粒。

  病毒污染

  组织细胞培养过程中,如果没有除去潜在的病毒,就会产生病毒污染。目前,从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。

  尽管病毒污染的细胞不影响原代培养,但生产疫苗是不安全的。因此,潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

  细胞交叉污染

  细胞污染和细菌污染不同,细胞污染是由于在培养过程中各种细胞同时进行,而所用器具或液体混杂使用所致。这种污染没有微生物存在,但使培养细胞不同种类之间发生混乱,细胞生长特性,形态发生变化。有些变化轻微,不易察觉,有些则可能由于污染的细胞具有生长优势而最终压过原来细胞而导致细胞生长的抑制,最终死亡。污染过的细胞由于种类不纯,无法进行实验研究。

  预防污染方法需要考虑的注意事项

  进入培养间时,保持双手洁净。使用肥皂彻底清洗后,酒精干燥(不用纸巾)

  佩戴手套(保证手套可以被消毒)

  穿着带有松紧袖口的实验服

  不要随便触碰无关物品(例如:电话、门把手、甚至说是整理头发等)

  避免佩戴手表、戒指和其他首饰

  脱去在其他地方接触过动物的衣服

  患有感冒的人员需佩戴面罩

  良好规范的操作

  为您的CO2培养箱建立一套日常的标准清洗程序(清洁区域需要包括培养箱周围的区域,特别是培养箱的顶部)

  经常检查实验室的其他设备是否受到污染(例如:洗手池/离心机等)

  有计划放置您的培养箱,尽量减少开门时间和不必要的移动

  快速开关CO2培养箱

  限制使用同一培养箱的人数

  尽快清除溢出物,之后用酒精清洁

  舍弃水纯化系统最初得到的水

  注重培养过程

  细胞培养需要经常性地检查是否被污染

  使用半个开放培养皿盛放组织培养基。开口放置于培养箱中1至4个小时。盖上培养皿盖子。37℃培养24-72小时。观察现象。

  早期发现污染可以提高培养物存活的几率

  不要混用、共享培养皿或培养基

  不要令盛放培养基的容器开口放置过长时间

  完全被污染的培养涉及物需要用高压灭菌消毒

  尽量使用一次性预灭菌培养耗材

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/508.html

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