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传代培养实验操作步骤

2022-12-13 10:22:36
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  传代培养即将细胞消化稀释,分装到两个或两个以上的培养瓶或培养皿中使之继续生长的过程。

  一般认为原代细胞是指从原代培养的第1代传至第10代的细胞;细胞系为原代细胞首次传代成功的细胞;细胞株则是传代培养过程中培养的第10代至第50代细胞,其遗传物质较原代细胞发生改变,具有无限增殖的能力。

传代培养实验操作步骤

  1 贴壁培养

  细胞传代培养操作步骤如下:

  (1)传代前在倒置显微镜下观察细胞形态和生长密度,当细胞生长密度达到80%~90%时,即可进行传代。

  (2)吸掉或倒掉培养瓶内的培养液。加入PBS清洗1~2次,左右轻轻摇晃后弃掉。

  (3)根据培养瓶大小向瓶内加入适量含EDTA的胰蛋白酶,一般应覆盖整个培养瓶底。

  (4)把培养瓶放入37℃ CO2培养箱进行消化,2~5min后拿出放在倒置显微镜下进行观察,当发现有70%~80%细胞收缩变圆、细胞间隙变大时,再轻轻拍打培养瓶使剩余细胞脱落,然后立即加入2倍胰蛋白酶量的培养液中止消化,使用吸头轻轻吹打,混合均匀,以防消化过度。

  (5)吸出所有细胞悬液至离心管内,1000rpm/min离心3~5min。

  (6)弃上清,加入适量培养液重悬细胞,轻轻吹打混匀,使细胞均匀分散。

  (7)用吸头吸取适量细胞悬液,以适宜的密度接种于新的培养瓶中,补足培养液,摇匀,放置于37℃ CO2培养箱中进行培养。

  (8)根据细胞生长状态确定换液或传代时间,甚至进行细胞冻存。

  2 悬浮细胞

  传代培养操作步骤如下:

  一般实验室中悬浮细胞传代方法分为直接传代法和离心传代法(培养液中含有细胞碎片的情况下)。当在显微镜下观察到悬浮细胞已经长满至80%~90%(细胞悬液变黄)时,即可进行传代。

  2.1 直接传代法

  (1)显微镜下观察到细胞状态良好,基本无细胞碎片。

  (2)立起细胞瓶使细胞自然沉降,用吸头吸取1/2~2/3细胞上清液,弃掉。

  (3)加入新鲜培养液重悬细胞,以适宜的密度接种于新的培养瓶中,补足培养液,摇匀,放置于培养箱中进行培养。

  2.2 离心传代法

  (1)用吸头吸取全部细胞悬液至离心管内,1000rpm/min离心3~5min。

  (2)弃上清,加入适量培养液重悬细胞,轻轻吹打混匀,使细胞均匀分散。

  (3)用吸头吸取适量细胞悬液,以适宜的密度接种于新的培养瓶中,补足培养液,摇匀,放置于培养箱中进行培养。

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