Transwell实验

发布日期:2021-08-19 03:17:26

类目:细胞实验

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  Transwell实验:铺Matrigel胶,细胞重悬液接种一定数量的细胞于上室,下室放入含20%血清的完全培养基,培养箱培养24小时,固定后,加入结晶紫染液,显微镜下拍摄。

Transwell实验
 

  Transwell侵袭实验的具体步骤

  一、实验材料(提前1天准备)

  a)Transwell小室

  b)基质胶:常用的是人工重构基底膜材料Matrigel,需要提前12h将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜。因其4℃时是液体,在 37℃会逐渐凝固成胶状,且不可逆。它能在培养基中重建形成膜结构,这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。如果购买的小室是已经铺好基质胶的,那么Matrigel就不需要购买了;

  c)上层培养液:上层培养液采用无血清培养基,为维持渗透压,可以加入0.05%-0.2%BSA;

  d)下层培养液:下层培养液采用含5%-10%FBS的培养基,具体浓度根据细胞转移力而定,转移力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子“引诱”细胞转移,如将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子;

  e)细胞培养板:常用6孔板、12孔板、24孔板等。其中,以24孔板最常用,下面就以24孔板为例。

  二、操作步骤

  1.铺基质胶:在4℃条件下将Matrigel胶用无血清的细胞培养基或PBS缓冲液按照1:8比例稀释(其稀释比例需要摸索,选择一个细胞穿过适中的浓度即可),取100μl均匀涂抹于上室的聚碳酸酯膜表面,37℃放置0.5-1h,使其聚合成凝胶;

  Tips:

  a) 将枪头沿小室内壁将Matrigel轻轻打出,切忌戳到小室滤膜;

  b) 加入的Matrigel胶的体积不可太大,把聚碳酸酯膜浸湿即可;

  c) 注意低温,枪头、小室等都应该4℃预冷。

  2.细胞培养:取对数生长期的待测细胞,并用PBS洗涤,接着用无血清培养基悬浮细胞,调整细胞密度为1-10*105/ml;

  3.接种细胞:在24孔板下室一般加入500-650 μL 含 5%-10%FBS 或趋化因子的培养基,然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内,取细胞悬液100-200μL 加入上室,最后放入培养箱中培养12-48h(根据癌细胞的转移能力而定)。

  Tips:

  a) 尽量避免气泡的产生:下层培养液和小室间常会有气泡产生,会影响下层培养液的趋化作用。因此一旦出现大气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板;

  b) 注意细胞一定要接种均匀,建议沿着壁缓慢加入;

  c) 时间点的选择除了要考虑到细胞的转移能力以外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视,如某些药物会抑制细胞的增殖。

  4.细胞固定:取出小室,吸走培养基,用棉签轻轻擦拭Matrigel和上室内的细胞。取新的24孔板加入4%多聚甲醛600μL,将小室放入后固定20-30min。

  5.细胞染色及计数:弃固定液,用0.1-%0.2%结晶紫染色5-10min,PBS洗3遍,除去未与细胞结合的结晶紫,用棉签轻轻擦拭小室的上侧,将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉,以便后续镜检。适当风干后,在高倍显微镜下选取5个视野观察细胞并计数。