PCR实验

发布日期:2021-08-02 02:11:37

类目:分子实验

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  PCR实验PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。

  PCR技术的基本原理

  一.PCR反应成分:

  1.模板DNA;2.引物;3.四种脱氧核糖核苷酸;

  4.DNA聚合酶;5.反应缓冲液、Mg2 等。

  二.PCR反应基本步骤:

  1.变性:高温使双链DNA解离形成单链(94℃,30s)。

  2.退火:低温下,引物与模板DNA互补区结合(55℃,30s)。

  3.延伸:中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应(70~72℃,30~60s)

  1.变性(denaturation):通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂,双链分开而成单链的过程。

  2.退火(annealling):当温度降低时,引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。

  3.延伸(extension):在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2 存在下,DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸,合成出与模板DNA链互补的DNA子链。

  以上述三个步骤为一个循环,每一循环的产物均可作为下一个循环的模板,经过n次循环后,目的DNA以2n的形式增加。

  PCR实验中注意事项

  1)所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。

  2)所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水,用0.22μm过滤的,并且是高压灭菌。

  3)在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂,在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。

  4)所用试剂都应该以大体积配制,实验一下看试剂是否满意,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。

  5)所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。

  6)新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。

  7)样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。

  荧光定量 PCR 中的一些术语

  CT值:荧光信号有统计意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数,或者说是从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。

  阈值:阈值的默认设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。

  CT值与起始模板的量成线性关系。